淋巴細(xì)胞微粒引起支氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　淋巴細(xì)胞微粒(lymphocytemicroparticles,LMPs)是當(dāng)淋巴細(xì)胞受刺激活化或凋亡時(shí)從漿膜上脫落下來(lái)成為直徑為0.05-1.0μm的小囊泡顆粒,可通過(guò)與靶細(xì)胞的相互作用啟動(dòng)靶細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[1]。它具有抗凝、促炎反應(yīng)、加重內(nèi)皮損傷、影響血管收縮、誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[2],尤其在慢性炎癥方面作用突出,現(xiàn)已證實(shí)它與自身免疫性疾病關(guān)系密切。
　　新近研究發(fā)現(xiàn),LMP

2、s能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡,能夠作用于內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素6(interleuki-6,IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleuki-8,IL-8)、前列腺素(Prostaglandin,PG)等的表達(dá)[3],進(jìn)而在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面起重要作用,但具體機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)患者外周血T淋巴細(xì)胞總數(shù)下降,凋亡增加,在急性加重期尤為突

3、出[4]。我們課題組初步發(fā)現(xiàn)COPD患者的肺泡灌洗液中LMPs水平是升高的,但凋亡的T淋巴細(xì)胞所釋放的LMPs是否對(duì)氣道上皮細(xì)胞有影響,是否在氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,目前在國(guó)內(nèi)外尚缺乏研究報(bào)道。針對(duì)這一現(xiàn)象我們加以假設(shè)展開(kāi)研究。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn),LMPs能抑制人支氣管上皮細(xì)胞(Humanbronchialepithelialcells,16HBE)生長(zhǎng),使其生長(zhǎng)周期阻滯在G1期,并且能誘導(dǎo)其凋亡,但引起16HBE細(xì)

4、胞生長(zhǎng)周期阻滯的具體機(jī)制尚不完全清楚[5]。因此,本研究擬通過(guò)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期調(diào)控基因以及相關(guān)周期蛋白的變化檢測(cè),探討LMPs引起16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯的機(jī)制。以期為研究LMPs在氣道炎癥中所發(fā)揮的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為下一步構(gòu)建疾病動(dòng)物模型作鋪路,最終為呼吸專(zhuān)科常見(jiàn)的哮喘和慢性阻塞性肺氣腫等慢性氣道炎癥性疾病防治提供新的思路。
　　方法
　　本實(shí)驗(yàn)采用人類(lèi)正常支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),對(duì)LMPs作用于16

5、HBE細(xì)胞引起生長(zhǎng)周期阻滯的相關(guān)調(diào)控蛋白進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行探討。具體如下:
　　1、LMPs致16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯相關(guān)周期蛋白的研究
　　1.1RT-PCR檢測(cè)P21、P27、P57、P16的mRNA的水平表達(dá)
　　將16HBE細(xì)胞培養(yǎng)在六孔板中到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),20μg/ml的LMPs按照不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、20h、24h刺激16HBE細(xì)胞,提取總的RNA。采用引物延伸法,擴(kuò)展目的片段,

6、取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳跑電泳進(jìn)行分析。并用GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)。GIS密度分析軟件分析目的基因條帶的灰度值。
　　1.2Westernblot檢測(cè)P21、P27蛋白水平表達(dá)
　　將16HBE細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),20μg/ml的LMPs按照不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE細(xì)胞。提取蛋白,跑電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育抗體,ECL試劑反應(yīng)顯影;圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值比值。
　　2、LMPs致16H

7、BE細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯機(jī)制的研究
　　2.1Westernblot檢測(cè)p-FOXO1、FOXO1、p-AKT、AKT蛋白水平的表達(dá)情況
　　將16HBE細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),20μg/ml的LMPs按照不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE細(xì)胞。提取蛋白,跑電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育抗體,ECL試劑反應(yīng)顯影;圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值比值。
　　2.2激光共聚焦觀察FOXO1蛋白的核定位變化
　　按照1.5×

8、104個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植16HBE細(xì)胞爬片,60-70％的融合率時(shí),按照0h、24h的時(shí)間點(diǎn)加入濃度為20μg/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)胞。然后固定,通透,孵育抗體,染核,封片;激光共聚焦觀察。
　　2.3加入抑制劑LY294002后,Westernblot檢測(cè)p-AKT、AKT、p-FOXO1、FOXO1蛋白水平的表達(dá)情況
　　60-70%的融合率時(shí),向16HBE細(xì)胞中加入濃度為20μm/L的LY294002,共培

9、養(yǎng)24h后,加入20μg/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)胞24h。提取蛋白,跑電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育抗體;ECL試劑反應(yīng)顯影;圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值比值。
　　2.4加入抑制劑LY294002后,激光共聚焦觀察FOXO1蛋白的核定位變化
　　按照1.5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植爬片,60-70%的融合率時(shí),向16HBE細(xì)胞中加入濃度為20μm/L的LY294002共培養(yǎng)24h后,加入濃度為20μg/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)

10、胞24h。然后固定,通透,孵育抗體,染核,封片;激光共聚焦觀察。
　　2.5加入抑制劑LY294002后,Westernblot檢測(cè)P21、P27蛋白水平的表達(dá)情況
　　60-70%的融合率時(shí),向16HBE細(xì)胞中加入濃度為20μm/L的LY294002共培養(yǎng)24h后,20μg/ml的LMPs加入刺激16HBE細(xì)胞24h。提取蛋白,跑電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育抗體;ECL試劑反應(yīng)顯影;圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值比值。
　　結(jié)果:

11、>　　1、LMPs致16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯相關(guān)周期蛋白的研究
　　1.1濃度為20μl/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)胞,24h能夠使其生長(zhǎng)周期阻滯在G1期(P<0.01)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),P21、P27在mRNA水平隨著時(shí)間點(diǎn)的變化顯著升高(P<0.01),而P57、P16在mRNA水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　1.2Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),P21、P27在蛋白水平隨時(shí)間點(diǎn)的變化表達(dá)亦明顯升高,具

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　2、LMPs致16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯機(jī)制的研究
　　2.1Westernblot檢測(cè)FOXO1、p-FOXO1、AKT、p-AKT蛋白水平變化情況,結(jié)果顯示:FOXO1、AKT的總表達(dá)水平無(wú)明顯變化;但p-FOXO1、p-AKT表達(dá)水平隨時(shí)間點(diǎn)變化逐漸減弱(P<0.01)。
　　2.2細(xì)胞免疫化學(xué)觀察到FOXO1在24h明顯入核的現(xiàn)象(與0h比較))。
　　2.3加入抑制劑

13、LY294002后,FOXO1、AKT蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化,但其磷酸化水平增強(qiáng)(P<0.01);FOXO1的核定位在24h后未觀察到明顯的進(jìn)核現(xiàn)象,P21、P27蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯增高(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.LMPs作用于16HBE細(xì)胞引起其生長(zhǎng)周期阻滯在G1期,是通過(guò)上調(diào)P21、P27的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　2.LMPs抑制16HBE細(xì)胞的生長(zhǎng)可能與p-AKT以及FOXO1的核定位有關(guān)。
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