TAT蛋白轉導結構域介導的人bFGF融合蛋白表達載體的構建、表達、純化及其穿透細胞膜作用的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的構建含HIV-1的反式激活蛋白Tat蛋白轉導結構域(Tat-protein transduction domain,TatPTD)的人堿性成纖維細胞生長因子(human basic Fibroblast Growth Factor,hbFGF)表達載體,誘導表達并對表達產物進行分離純化,用純化的融合蛋白做細胞因子活性檢測及研究含TatPTD介導的hbFGF在體外細胞實驗中跨膜轉運作用.方法用RT-PCR法擴增TatPTD-hbFGF

2、的基因片段,擴增產物與T-Vector連接,構建表達載體pGEM-T-TatPTD-hbFGF.在宿主菌中擴增重組質粒,提取質粒并進行酶切純化,將目的基因插入pET-28b中構建成表達載體,轉化入大腸桿菌XL1-blue,藍白選擇、耐藥性標記粗篩并挑取陽性克隆,經限制性內切酶酶譜分析、DNA序列分析兩種方法鑒定.然后提取重組質粒,轉化入大腸桿菌BL-21,用IPTG誘導表達.包涵體形式表達的融合蛋白經去污劑變性,梯度透析后,穿陰離子交換

3、樹脂,得到所需純化目的蛋白.對純化目的蛋白用ECV304細胞做MTT細胞因子活性檢測.并用免疫細胞化學方法對含TatPTD的hbFGF與不含TatPTD的hbFGF在生物膜穿透性方面進行初步研究.結果經限制性內切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證明所構建質粒為pET-28b-TatPTD-hbFGF重組質粒;SDS-PAGE證實獲得的融合蛋白分子量為21.5kD,表達量約占菌體總蛋白的24％.純化的蛋白純度為99%;免疫細胞化學研究表明,

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