新城疫病毒HN蛋白與F蛋白結(jié)構(gòu)域共表達(dá)對(duì)細(xì)胞融合的影響.pdf

1、新城疫(Newcastledisease，ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的急性傳染病之一，該病病原新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)屬于副粘病毒科腮腺炎病毒屬，是一種有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，在其囊膜上有兩種重要的功能蛋白纖突，即融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)，它們是NDV的致病基礎(chǔ)和主要宿主保護(hù)性抗原，也是與細(xì)胞融合密切相關(guān)的兩個(gè)糖蛋白。既表達(dá)黏附蛋白又表達(dá)F蛋白的感染細(xì)胞能夠融合鄰近的細(xì)胞形成多核細(xì)

2、胞或稱核胞體，HN蛋白和F蛋白對(duì)于細(xì)胞融合來(lái)說(shuō)都是必需的。 由于這兩種蛋白分子量較大不易表達(dá)，且其免疫原性主要決定于抗原表位，故本研究分析了HN蛋白的抗原結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了HN蛋白結(jié)構(gòu)域基因片段原核和真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的F蛋白結(jié)構(gòu)域基因片段真核重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行了HN和F蛋白共表達(dá)對(duì)細(xì)胞融合影響的實(shí)驗(yàn)研究。 本文用PCR方法獲得了NDVHN蛋白結(jié)構(gòu)域基因HNa和HNb，并通過(guò)重疊-延伸PCR對(duì)二者進(jìn)行重

3、組，獲得了HNa-L-b片段。將三種基因片段插入原核表達(dá)載體pET32c，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了表達(dá)，Westernblotting分析證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物HNa和HNb與NDV陽(yáng)性血清具有免疫反應(yīng)性。根據(jù)westernblotting結(jié)果，將含HNa和HNb重組質(zhì)粒的重組菌大量表達(dá)，并通過(guò)鎳瓊脂糖凝膠純化，免疫家兔，制備了抗HNa和抗HNb的多抗。 將HN蛋白結(jié)構(gòu)域基因片段HNa、HNb和HNa-L-b插入真核表

4、達(dá)載體pcDNA3的CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pcDNA3-HNa、pcDNA3-HNb。將這兩種質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pcDNA3-HN、pcDNA3-F和pcDNA3-Fa(c)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，分別用新城疫陽(yáng)性血清和制備的多抗檢測(cè)，用FITC標(biāo)記的特異性二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，均可以觀察到特異性黃綠色熒光，說(shuō)明重組質(zhì)粒能夠在HeLa細(xì)胞中表達(dá)具有免疫反應(yīng)性的目的蛋白。 將F全長(zhǎng)、Fa(c)片段真核表

5、達(dá)重組質(zhì)粒分別與HN全長(zhǎng)、HNa和HNb片段真核表達(dá)重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下逐一共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h，F(xiàn)a(c)片段與HNa、HNb共轉(zhuǎn)染孔就觀察到了細(xì)胞融合，36h后每個(gè)共轉(zhuǎn)染孔都觀察到了細(xì)胞融合，同時(shí)用間接免疫熒光的方法也檢測(cè)到了細(xì)胞融合，即合胞體。單獨(dú)轉(zhuǎn)染孔均未觀察到細(xì)胞融合。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，不同組合共轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞融合都有一定促進(jìn)，其中Fa(c)片段與HNa、HNb共轉(zhuǎn)染促融合更為明顯，可能與這三個(gè)片段較小易表達(dá)且保留了融合

6、所需的結(jié)構(gòu)有關(guān)。 本研究的目的是，對(duì)所選的HN基因結(jié)構(gòu)域片段篩選，選出表達(dá)量較高且有良好免疫反應(yīng)性的；探索F和HN基因結(jié)構(gòu)域片段重組質(zhì)粒共表達(dá)對(duì)細(xì)胞融合產(chǎn)生的影響。因此，本研究初步分析了HN蛋白的主要抗原表位，探討了同源HN蛋白和F蛋白共表達(dá)對(duì)細(xì)胞融合的作用。所選用的幾個(gè)片段表達(dá)的蛋白都具有抗原性；F蛋白與HN蛋白不同片段組合共轉(zhuǎn)染都可以促進(jìn)細(xì)胞融合；不同組合對(duì)融合的促進(jìn)程度不同，可能與所選取的片段有關(guān)。本研究對(duì)于進(jìn)一步探明F和