TAT-BPI-gB融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建研究.pdf

1、為了有效減少細(xì)菌的抗藥性,促進(jìn)對(duì)感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌有效清除,尤其是針對(duì)革蘭陰性菌感染,研究對(duì)抗內(nèi)毒素特異有效的制劑。本實(shí)驗(yàn)利用①人體免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus HIV)的逆轉(zhuǎn)錄因子(trans-activator TAT)蛋白的功能-促進(jìn)HIV病毒進(jìn)入分裂或未分裂細(xì)胞；②巨細(xì)胞病毒(Humancytomegalovirus HCMV)嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性-特異性與單核巨噬細(xì)胞結(jié)合。擬將HCMV結(jié)合受體膜

2、糖蛋白gB中保守基因AD1及具有泛嗜性TAT蛋白與BPI基因融合表達(dá),旨在賦予修飾后BPI一個(gè)新的功能:可以高效率穿透細(xì)胞膜或者多種屏障,如血腦屏障或菌膜,同時(shí)利用巨噬細(xì)胞的導(dǎo)向作用使融合蛋白具有中和不同解剖分布狀態(tài)的LPS的功能,結(jié)果在于①對(duì)LPS-LBP、LPS-HDL有中和作用,具有延時(shí)保護(hù)效果；②細(xì)胞內(nèi)感染細(xì)菌有清除作用,預(yù)防感染的復(fù)發(fā)；③中和活性較單純BPI進(jìn)一步提高；④提高BPI的滲透作用,有利于治療各種難治性感染；⑤改變普

3、通抗生素的作用機(jī)制,減少細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性,從而為臨床膿毒癥及敗血癥、內(nèi)毒素血癥等的治療找到一條新的有效途徑。
　　 目的:為使BPI能高效率穿透細(xì)胞膜或多種屏障,中和不同解剖部位的LPS,構(gòu)建TAT-BPI-gB原核表達(dá)載體并鑒定,為研制以BPI為基礎(chǔ)的多肽抗生素打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.BPI cDNA片段的擴(kuò)增:PMN提取,Trizol提取細(xì)胞總RNA,將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用特異性BPI引物進(jìn)行

4、PCR得到BPIDNA片段。
　　 2.pUC57-TAT-BPI重組質(zhì)粒的構(gòu)建:將人工合成的TAT互補(bǔ)單鏈混合,得到雙鏈片段。將TAT雙鏈片段經(jīng)PaeⅠ、SalⅠ雙酶切后,與pUC57載體連接,構(gòu)建pUC57-TAT重組質(zhì)粒。將PCR擴(kuò)增得到的BPI片段用SalⅠ、KpnⅠ雙酶切后,與重組質(zhì)粒pUC57-TAT連接,電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,提取質(zhì)粒并鑒定。
　　 3.gB DNA片段的擴(kuò)增:依據(jù)Genebank中GQ

5、166969提供的UL55基因序列,人工合成人巨細(xì)胞病毒糖蛋白gB的UL55編碼中AD1序列,利用gB引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到該DNA片段。
　　 4.pUC57-TAT-BPI-gB融合蛋白載體的構(gòu)建:將PCR擴(kuò)增得到的gB片段用KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后,與重組質(zhì)粒pUC57-TAT-BPI連接,電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,提取質(zhì)粒并酶切及測(cè)序鑒定。
　　 5.同源性分析:應(yīng)用計(jì)算機(jī)blast軟件將重組蛋白TAT-BP

6、I-gB與Genebank中TAT(YGRKKRRQRRR)序列、gB序列UL55(28個(gè)氨基酸)和BPI全序列AF322588中N端(1-597基因片段)等參照序列進(jìn)行同源性分析比較。
　　 結(jié)果：1％瓊脂糖凝膠電泳顯示BPI基因大小約600bp、ga基因約80bp。pUC57-TAT-BPI和pUC57-TAT-BPI-gB重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定,1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶在600bp和700bp左右。同源性分析TA

7、T序列中,第10,30位核苷酸有突變,核苷酸同源性為93％,氨基酸同源性為90％；在BPI序列中,234,454,495,556位核苷酸有突變,核苷酸同源性為98％,氨基酸同源性為95％；在ga序列中,15,27,36,43,53,61,74位核苷酸有突變,核苷酸同源性為91％,氨基酸同源性為93％。
　　 結(jié)論：
　　 1.從肺炎患者中性粒細(xì)胞中,利用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴(kuò)增出BPIN端基因片段。
　　 2.將TA