TAT-BPI-gB融合蛋白原核表達載體的構(gòu)建研究.pdf

1、為了有效減少細菌的抗藥性,促進對感染細胞內(nèi)細菌有效清除,尤其是針對革蘭陰性菌感染,研究對抗內(nèi)毒素特異有效的制劑。本實驗利用①人體免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus HIV)的逆轉(zhuǎn)錄因子(trans-activator TAT)蛋白的功能-促進HIV病毒進入分裂或未分裂細胞；②巨細胞病毒(Humancytomegalovirus HCMV)嚴格的細胞嗜性-特異性與單核巨噬細胞結(jié)合。擬將HCMV結(jié)合受體膜

2、糖蛋白gB中保守基因AD1及具有泛嗜性TAT蛋白與BPI基因融合表達,旨在賦予修飾后BPI一個新的功能:可以高效率穿透細胞膜或者多種屏障,如血腦屏障或菌膜,同時利用巨噬細胞的導向作用使融合蛋白具有中和不同解剖分布狀態(tài)的LPS的功能,結(jié)果在于①對LPS-LBP、LPS-HDL有中和作用,具有延時保護效果；②細胞內(nèi)感染細菌有清除作用,預防感染的復發(fā)；③中和活性較單純BPI進一步提高；④提高BPI的滲透作用,有利于治療各種難治性感染；⑤改變普

3、通抗生素的作用機制,減少細菌產(chǎn)生抗藥性,從而為臨床膿毒癥及敗血癥、內(nèi)毒素血癥等的治療找到一條新的有效途徑。
　　 目的:為使BPI能高效率穿透細胞膜或多種屏障,中和不同解剖部位的LPS,構(gòu)建TAT-BPI-gB原核表達載體并鑒定,為研制以BPI為基礎(chǔ)的多肽抗生素打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.BPI cDNA片段的擴增:PMN提取,Trizol提取細胞總RNA,將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用特異性BPI引物進行

4、PCR得到BPIDNA片段。
　　 2.pUC57-TAT-BPI重組質(zhì)粒的構(gòu)建:將人工合成的TAT互補單鏈混合,得到雙鏈片段。將TAT雙鏈片段經(jīng)PaeⅠ、SalⅠ雙酶切后,與pUC57載體連接,構(gòu)建pUC57-TAT重組質(zhì)粒。將PCR擴增得到的BPI片段用SalⅠ、KpnⅠ雙酶切后,與重組質(zhì)粒pUC57-TAT連接,電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α,提取質(zhì)粒并鑒定。
　　 3.gB DNA片段的擴增:依據(jù)Genebank中GQ

5、166969提供的UL55基因序列,人工合成人巨細胞病毒糖蛋白gB的UL55編碼中AD1序列,利用gB引物進行PCR擴增得到該DNA片段。
　　 4.pUC57-TAT-BPI-gB融合蛋白載體的構(gòu)建:將PCR擴增得到的gB片段用KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后,與重組質(zhì)粒pUC57-TAT-BPI連接,電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α,提取質(zhì)粒并酶切及測序鑒定。
　　 5.同源性分析:應(yīng)用計算機blast軟件將重組蛋白TAT-BP

6、I-gB與Genebank中TAT(YGRKKRRQRRR)序列、gB序列UL55(28個氨基酸)和BPI全序列AF322588中N端(1-597基因片段)等參照序列進行同源性分析比較。
　　 結(jié)果：1％瓊脂糖凝膠電泳顯示BPI基因大小約600bp、ga基因約80bp。pUC57-TAT-BPI和pUC57-TAT-BPI-gB重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定,1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶在600bp和700bp左右。同源性分析TA

7、T序列中,第10,30位核苷酸有突變,核苷酸同源性為93％,氨基酸同源性為90％；在BPI序列中,234,454,495,556位核苷酸有突變,核苷酸同源性為98％,氨基酸同源性為95％；在ga序列中,15,27,36,43,53,61,74位核苷酸有突變,核苷酸同源性為91％,氨基酸同源性為93％。
　　 結(jié)論：
　　 1.從肺炎患者中性粒細胞中,利用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴增出BPIN端基因片段。
　　 2.將TA