百脈根小GTPase POP6與網(wǎng)格重鏈蛋白CHC相互作用的研究.pdf

1、根瘤菌所產(chǎn)生的結(jié)瘤因子是豆科植物與根瘤菌建立共生固氮體系的信號(hào)分子，豆科植物L(fēng)ysM-RLK是識(shí)別根瘤菌結(jié)瘤因子的受體激酶。在模式豆科植物百脈根中結(jié)瘤因子受體激酶被命名為NFR1和NFR5，它們可能形成異源二聚體共同識(shí)別和接受結(jié)瘤因子而開(kāi)啟宿主內(nèi)共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。為了深入理解豆科植物與根瘤菌共生體形成的機(jī)制，本研究在分離到與結(jié)瘤因子受體激酶NFR5相互作用的小G蛋白R(shí)OP6的基礎(chǔ)上，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)，從百脈根AD-cDNA文庫(kù)中篩選并

2、鑒定出與ROP6相互作用的陽(yáng)性克隆。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．對(duì)得到的酵母陽(yáng)性克隆子，經(jīng)分離靶質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增、酶切鑒定證實(shí)含有外源片段及其大小，并通過(guò)回轉(zhuǎn)酵母進(jìn)一步驗(yàn)證與誘餌質(zhì)粒上ROP6間的相互作用。然后，經(jīng)DNA序列測(cè)定和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST分析結(jié)果表明，其目的DNA編碼網(wǎng)格重鏈蛋白CHC的兩個(gè)模體，命名為CHCR。
　　 2．在酵母體內(nèi)研究了網(wǎng)格重鏈蛋白CHCR與ROP6、CA突變體(ROP6組成型活化突

3、變體)和DN突變體（ROP6功能缺失突變體）間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ROP6的兩種突變體都能與網(wǎng)格重鏈蛋白CHCR互相作用。
　　 3．分別在大腸桿菌中表達(dá)并純化CBD-CHCR和His-ROP6融合蛋白，利用Pull-down技術(shù)證實(shí)了CHCR和ROP6的體外相互作用。同時(shí)，雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)研究結(jié)果說(shuō)明了CHCR和ROP6在煙草葉片表皮細(xì)胞中的相互作用。
　　 4．利用酵母雙雜交技術(shù)，研究了與ROP6相互