百脈根AD-cDNA文庫的構(gòu)建及與結(jié)瘤因子受體NFR1相互作用蛋白的鑒定.pdf

1、根瘤菌能與豆科植物特異的形成根瘤，植物通過光合作用為根瘤菌提供碳源，根瘤菌含有的固氮酶將空氣中的氮還原從而為植物提供氮源。根瘤的發(fā)生起始于植物分泌的一種類黃酮化合物信號分子，這種信號分子作用于根瘤菌，促使根瘤菌分泌結(jié)瘤因子(Nod factor)，結(jié)瘤因子作為根瘤菌共生信號分子作用于寄主植物，引起植物一系列形態(tài)、生理生化變化而產(chǎn)生根瘤。結(jié)瘤因子受體1(Nod factor receptor1，NFR1)是從百脈根不結(jié)瘤突變株中分離得到的

2、基因，它負(fù)責(zé)接受結(jié)瘤因子并將信號向下傳遞。NFR1的蛋白包括3個部分：N-端的膜外部分含有2個Lys-M結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)結(jié)瘤因子的接受，中間含有跨膜結(jié)構(gòu)(TM)，C-端的膜內(nèi)部分含有磷酸激酶(Protein kinase)結(jié)構(gòu)域。NFR1自發(fā)現(xiàn)以來，其下游的信號接收分子仍未探明。酵母雙雜交是近年來發(fā)展起來研究蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)，常用于蛋白之間作用的體內(nèi)鑒定。為了弄清NFR1下游的信號流向，進(jìn)一步闡明結(jié)瘤因子信號傳遞途徑，我們構(gòu)建了一個

3、百脈根AD-cDNA文庫，通過酵母雙雜交技術(shù)，以NFR1為誘餌，在文庫中找尋與NFR1相互作用的蛋白，為確定NFR1的信號傳遞相關(guān)基因提供候選者。 貧栽培養(yǎng)百脈根，接種后分2d，4d，6d，8d，12d分別收獲根部組織。將收獲的根部組織混合，提取總RNA。通過RT-PCR得到cDNA，在cDNA兩端加上接頭，與帶有接頭的線性化的質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，帶有接頭的cDNA和pGADT7-Rec在酵母細(xì)胞內(nèi)

4、通過同源重組而成環(huán)化質(zhì)粒，cDNA插入片斷整合到GAL4 AD之后，在酵母體內(nèi)與GAL4 AD融合表達(dá)。在SD/-Leu培養(yǎng)基上篩選文庫轉(zhuǎn)化子，待轉(zhuǎn)化子生長出5d后，以Freezing Medium(含25％(v/v)甘油的YPD)收集所有轉(zhuǎn)化子，并分裝為1ml/管，于-70℃保存。通過稀釋平板計數(shù)，計算得到文庫效率約為2×10<'6>，達(dá)到了每3ug pGADT7-Rec質(zhì)粒一百萬個轉(zhuǎn)化子的期望值.隨機(jī)挑選部分文庫菌落抽取質(zhì)粒，以為A

5、D Insert Screening引物做PCR，檢查文庫的空載率以及插入片斷平均長度，空載率為12.5％，平均片段長度在1.5kb左右。通過血球計數(shù)板計數(shù)，所得文庫的細(xì)胞濃度為2×10<'7>個/ml，達(dá)到了酵母雙雜交所需要的細(xì)胞濃度。 將NFR1的膜內(nèi)激酶區(qū)域克隆到pGBKT7上作為誘餌質(zhì)粒，再將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187。將含有誘餌質(zhì)粒的Y187與文庫菌AH109混合培養(yǎng)，Y187與AH109交配融合，通過報告基因的表達(dá)

6、，在四缺培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。初步篩選得到了120個克隆，將初篩得到的克隆在含X-Gal(80μg/ml)的四缺平板上復(fù)篩，得到80個變藍(lán)的克隆，初步確定變藍(lán)的菌落為陽性克隆。從陽性克隆中分離出AD質(zhì)粒，以AD質(zhì)粒為模版PCR擴(kuò)增cDNA插入片斷。將AD質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NFR1PK共轉(zhuǎn)化AH109，進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗證。挑選部分克隆測序，得到數(shù)種未知基因。以2d，4d，6d，8d，未接種的百脈根根部和百脈根葉，莖提取RNA，通過稀釋