百脈根結(jié)瘤信號(hào)通道蛋白NSP2及其相互作用蛋白IPN2的研究.pdf

1、豆科植物和根瘤菌共生關(guān)系的建立過(guò)程是兩者之間相互交換信號(hào)分子和能量的一系列復(fù)雜的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過(guò)程。根瘤菌分泌的一種稱為結(jié)瘤因子的脂幾丁質(zhì)寡糖，是根瘤菌與豆科植物相互識(shí)別的關(guān)鍵信號(hào)分子。豆科植物感知結(jié)瘤因子，改變一系列與結(jié)瘤相關(guān)基因的表達(dá)，引起表皮細(xì)胞膜去極化，細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度急增，根毛變形和皮層細(xì)胞的分裂，最終形成根瘤。百脈根結(jié)瘤信號(hào)通道蛋白NSP2是結(jié)瘤因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的必要元件之一。本實(shí)驗(yàn)致力于研究LjNSP2的轉(zhuǎn)錄激活和結(jié)合DNA

2、的能力，并尋找結(jié)瘤因子信號(hào)通路中與NSP2相互作用的新蛋白。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．RT-PCR從百脈根中擴(kuò)增得到全長(zhǎng)NSP1和NSP2基因。利用酵母菌株Y187中的報(bào)告基因LacZ，并測(cè)定兩者的β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果說(shuō)明NSPs在酵母細(xì)胞中都具有轉(zhuǎn)錄激活的能力，NSP1的β-半乳糖苷酶活性高于NSP2。
　　 2．對(duì)NSP2進(jìn)行序列分析，通過(guò)缺失突變構(gòu)建了四種不同的突變。利用報(bào)告基因LacZ，并測(cè)定突變型的β-

3、半乳糖苷酶活性，結(jié)果表明檢測(cè)不到β-半乳糖苷酶的存在，這四者都沒(méi)有激活轉(zhuǎn)錄的能力，NSP2的轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)段位于含有HPS結(jié)構(gòu)域的N-末端。
　　 3．通過(guò)酵母單雜交技術(shù)鑒定了百脈根NSPs具有結(jié)合DNA的能力。結(jié)果表明在酵母體內(nèi)，NSP1和NSP2都具有結(jié)合NIN基因啟動(dòng)子的能力，但都不能結(jié)合百脈根鈣離子結(jié)合蛋白（CBP1）基因的啟動(dòng)子。
　　 4．以缺失轉(zhuǎn)錄激活能力的pGBKT7-NSP2-1/Y187作為誘餌，從百脈

4、根酵母雙雜交AD-cDNA文庫(kù)中篩選出與NSP2相互作用的蛋白IPN2。運(yùn)用生物信息學(xué)分析，IPN2基因的大小為1947bp，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，編碼的蛋白含有358個(gè)氨基酸，分子量為40.1kD，屬于MYB-SANT超家族的新成員，其N-末端含有一個(gè)在多種植物中高度保守的Myb類結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域（第37到第88位氨基酸殘基），預(yù)測(cè)IPN2能夠形成Helix-turn-Hdix（HTH）結(jié)構(gòu)。
　　 5．利用Weste