急性血糖波動(dòng)導(dǎo)致心肌與主動(dòng)脈損傷的機(jī)制研究.pdf

1、近年來的研究表明，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展不僅與持續(xù)血糖水平相關(guān)，而且與血糖的波動(dòng)性密切相關(guān)，其中高血糖與心血管疾病的關(guān)系更是備受關(guān)注，在心血管疾病臨床診治工作中有25％-35％患者涉及糖代謝紊亂。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血糖波動(dòng)是糖尿病心血管并發(fā)癥強(qiáng)烈的先兆表現(xiàn)，提示短暫的高血糖在糖尿病的血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著直接和重要的角色。波動(dòng)性高血糖可顯著增加2型糖尿病的微血管病變和心血管死亡危險(xiǎn)。但其中的機(jī)制尚不完全清楚，有研究表明氧化應(yīng)激是所

2、有糖尿病并發(fā)癥損害發(fā)生的主要因素。氧化應(yīng)激可激活轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(Nuclear factor-KB，NF-κB)的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)，其中NF-κB是傳遞氧化應(yīng)激信號(hào)至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，而IL-6，TNF-α又可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，由此形成氧化應(yīng)激-炎癥-氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。細(xì)胞損傷的終

3、極表現(xiàn)就是細(xì)胞的死亡，而細(xì)胞死亡的方式主要有壞死和凋亡兩種。在像糖尿病這樣的慢性疾病中，凋亡與壞死相比可能起著更為重要的作用。心肌細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，沒有再生增殖能力，長期凋亡使其數(shù)量逐漸減少會(huì)導(dǎo)致心臟泵功能降低直至心力衰竭，也使得心肌對(duì)其他損傷如缺血的耐受明顯減弱，而血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙密切相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。因此，抗氧化治療治療，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。維生素C及維生素

4、E是目前最常用的抗氧化劑，但它們并不能有效地在組織或細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，哪種抗氧化劑的效果更好，也是目前研究的熱點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是傳統(tǒng)的祛痰劑（痰易凈），而且在臨床上已有廣泛應(yīng)用，無明顯不良反應(yīng)，近年發(fā)現(xiàn)NAC具有顯著的抗氧化作用。目前尚無關(guān)于急性血糖波動(dòng)在體的動(dòng)物模型。本研究采用給Wistar雄性大鼠間斷地從靜脈輸注50％葡萄糖溶液建立急性血糖波動(dòng)性動(dòng)物模型，探討血糖波動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥

5、反應(yīng)對(duì)心血管的影響及其中機(jī)制，并進(jìn)一步研究抗氧化劑NAC的應(yīng)用是否能減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料及方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 選取健康雄性Wistar大鼠24只，體重280-330g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔度Ⅰ級(jí)，隨機(jī)被分為4組，每組6只，分別為對(duì)照組、急性血糖波動(dòng)組、NAC干預(yù)組1、NAC干預(yù)組2，常規(guī)飼料，自由飲水，溫度22±1℃，濕度50％左右，明/暗周期為12h。
　　

6、 二、建立急性波動(dòng)性高血糖、NAC干預(yù)組大鼠動(dòng)物模型
　　 大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境3-5天后，用10％水合氯醛(按體重0.35 ml/100g)腹腔麻醉，然后進(jìn)行頸部動(dòng)靜脈插管術(shù)。右側(cè)頸靜脈導(dǎo)管延伸至右心房，左側(cè)頸動(dòng)脈導(dǎo)管延伸至主動(dòng)脈弓。兩側(cè)的導(dǎo)管均經(jīng)皮下延續(xù)至背部然后外置，導(dǎo)管末端用金屬釘封閉。動(dòng)脈置管用做采血，靜脈置管用做輸液。所有大鼠術(shù)后均恢復(fù)3天。然后進(jìn)行輸液，①對(duì)照組（A組）予0.9％生理鹽水，定時(shí)檢測血糖使血糖維持在5

7、.5mmol/L左右;②急性血糖波動(dòng)組（B組）予50％葡萄糖注射液間斷輸注，定時(shí)檢測血糖，使血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動(dòng)，即血糖控制在5.5mmol/L左右持續(xù)1小時(shí)，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時(shí)，如此循環(huán);③NAC干預(yù)組1（C組），輸入NAC（0.35mg·kg-1·min-1）及間斷輸入50％葡萄糖注射液，定時(shí)檢測血糖，使血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動(dòng)，即血糖控制在5.5mm

8、ol/L左右持續(xù)1小時(shí)，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時(shí)，如此循環(huán);④NAC干預(yù)組2（D組），輸入NAC（0.7mg·kg-1·min-1）及間斷輸入50％葡萄糖注射液，定時(shí)檢測血糖，使血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動(dòng)，即血糖控制在5.5mmol/L左右持續(xù)1小時(shí)，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時(shí)，如此循環(huán)。在實(shí)驗(yàn)的0h、2h、14h、26h、46h、48h分別從動(dòng)脈取血0.6ml，離心后取上清

9、以備用。對(duì)照組在輸注44小時(shí)給予50％葡萄糖注射液輸注，調(diào)整輸注速度，使血糖保持在20mmol/L左右至46小時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)大鼠輸液時(shí)間為48小時(shí)，在輸液結(jié)束后動(dòng)物稱重，予10％水合氯醛按0.3ml/100g腹腔注射麻醉動(dòng)物，固定于解剖臺(tái)，剪去胸部毛發(fā)，迅速打開胸腔，心內(nèi)取血5ml，3000轉(zhuǎn)/分離心15分，取上清于-70℃保存?zhèn)溆谩Ａ羧⌒募〖爸鲃?dòng)脈標(biāo)本。
　　 三、主要實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、采用葡萄糖氧化酶法測定血糖;比色

10、法檢測血清及組織勻漿中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，比色法檢測心肌及主動(dòng)脈勻漿中一氧化氮(Nitricoxide，NO)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)活性。
　　 2、采用免疫組化技術(shù)觀察心肌細(xì)胞及主動(dòng)脈中NF-κB表達(dá)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)及細(xì)胞間粘附因子-1(Intercellul

11、aradhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)。
　　 3、TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。
　　 4、采用RT-PCR技術(shù)檢測心肌及主動(dòng)脈中IL-6mRNA、TNF-αmRNA的表達(dá)。
　　 5、采用Western blot雜交技術(shù)檢測心肌及主動(dòng)脈中IκB激酶β(IκB kinase-β，IKKβ)、Bax、Bcl-2水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、活體急性血糖波動(dòng)動(dòng)物模型建立成功:

12、在急性血糖波動(dòng)組可見血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動(dòng)，即血糖控制在5.5mmol/L左右持續(xù)1小時(shí)，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時(shí)，如此循環(huán)48小時(shí)。
　　 2、急性血糖波動(dòng)組的大鼠氧化應(yīng)激水平明顯增加，主動(dòng)脈中的氧化應(yīng)激比心肌重，抗氧化劑應(yīng)用后可改善氧化應(yīng)激:①急性血糖波動(dòng)組大鼠血清和心肌及主動(dòng)脈勻漿中MDA水平較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著降低(P＜0.0

13、5)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異，主動(dòng)脈勻漿中MDA顯著高于心肌勻漿(P＜0.05);②急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌及主動(dòng)脈勻漿中GSH-PX水平較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著升高(P＜0.05)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異，主動(dòng)脈勻漿中GSH-PX水平顯著低于心肌勻漿（P＜0.05）;③急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌及主

14、動(dòng)脈勻漿中NO水平較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著降低(P＜0.05)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異，主動(dòng)脈勻漿中NO顯著高于心肌勻漿(P＜0.05);④急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌及主動(dòng)脈中iNOS相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著降低(P＜0.05)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著

15、性差異，主動(dòng)脈中iNOS相對(duì)表達(dá)量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 3、急性血糖波動(dòng)組大鼠的炎癥因子水平明顯增加，主動(dòng)脈中炎癥因子的表達(dá)比心肌增多，抗氧化劑應(yīng)用后可使炎癥因子表達(dá)減少:①急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌及主動(dòng)脈中IL-6mRNA及TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著降低(P＜0.05)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異，

16、主動(dòng)脈中IL-6mRNA及TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于心肌(P＜0.05);②急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌及主動(dòng)脈中ICAM-1相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著降低(P＜0.05)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異，主動(dòng)脈中ICAM-1相對(duì)表達(dá)量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 4、四組大鼠NF-κB相對(duì)表達(dá)量比較:急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌

17、及主動(dòng)脈中NF-κB相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著降低(P＜0.05)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異，主動(dòng)脈中NF-κB相對(duì)表達(dá)量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 5、四組大鼠心肌及主動(dòng)脈中IKKβ含量的比較:急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌及主動(dòng)脈中IKKβ含量較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，NAC干預(yù)組1較急性血糖波動(dòng)組顯著降低(P＜0.

18、05)，但和對(duì)照組比較無顯著性差異，干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異，主動(dòng)脈中IKKβ含量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 6、急性血糖波動(dòng)組中心肌及主動(dòng)脈中促凋亡蛋白表達(dá)增加，抑蛋白表達(dá)減少:急性血糖波動(dòng)組大鼠心肌及主動(dòng)脈組織中的Bax表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);加入NAC干預(yù)后，可見干預(yù)組1及2的Bax表達(dá)明顯低于急性血糖波動(dòng)組（P＜0.05），干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異。急性血糖波

19、動(dòng)組大鼠心肌及主動(dòng)脈中Bcl-2的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，加入NAC干預(yù)后，可見干預(yù)組1及2的Bcl-2表達(dá)明顯高于急性血糖波動(dòng)組（P＜0.05），干預(yù)組2與干預(yù)組1和對(duì)照組比較均無顯著性差異。急性血糖波動(dòng)組可見心肌及主動(dòng)脈內(nèi)皮有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，而NAC干預(yù)組1、NAC干預(yù)組2及對(duì)照組均未見細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1、急性血糖波動(dòng)可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞及主動(dòng)脈內(nèi)促凋亡基因蛋白表達(dá)增加:抑凋亡蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致心

20、肌細(xì)胞及主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，小劑量或大劑量NAC干預(yù)后促凋亡蛋白表達(dá)明顯降低，抑凋亡蛋白表達(dá)明顯增加，未檢測到凋亡，小劑量或大劑量NAC之間無差異。
　　 2、急性血糖波動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌及主動(dòng)脈中氧化應(yīng)激增強(qiáng)，IKKβ表達(dá)增多，啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路，炎癥因子表達(dá)明顯增加，NAC干預(yù)后可抑制氧化應(yīng)激，抑制通路的激活，減少炎癥因子的表達(dá)，但加大NAC干預(yù)劑量未見與低劑量組有差異。
　　 3、急性血糖波動(dòng)在主動(dòng)脈中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)