調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)大鼠糖尿病腎病的治療及機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】
　　 糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renaldisease, ESRD)的常見(jiàn)基礎(chǔ)疾病之一。遺憾的是，雖然經(jīng)過(guò)大量基礎(chǔ)和臨床協(xié)作研究，人們對(duì)糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制仍未闡明。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為DN 發(fā)病與腎小球的血流動(dòng)力學(xué)改變，系膜細(xì)胞多元醇代謝途徑異常、蛋白非酶糖化終末產(chǎn)物的生成、細(xì)胞因子的異常表達(dá)等因素密切相關(guān)。研究表明，ERS與胰島素抵抗，糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病密切相

2、關(guān)。DN 主要表現(xiàn)為高血糖、蛋白尿。已有研究表明兩者是ERS的主要刺激因素，由此推測(cè)ERS與DN的發(fā)病存在可能的聯(lián)系。近年來(lái)，糖尿病腎病其實(shí)質(zhì)是慢性微炎癥病變的觀點(diǎn)得到廣泛關(guān)注。已有研究表明炎癥是ERS的主要下游信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞代謝的生理病理活動(dòng)具有重要影響。由此推測(cè)，調(diào)控ERS 偶聯(lián)的炎癥信號(hào)通路必將成為有效的治療糖尿病腎病的新思路。4-苯基丁酸(4-PBA)是以穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力，運(yùn)輸突變蛋白而著稱(chēng)的分子伴侶，已在多種動(dòng)

3、物模型中成功應(yīng)用。因此，應(yīng)用4-PBA 調(diào)控ERS 有可能為臨床DN 防治的研究提供新的理論依據(jù)。
　　 【研究目的】
　　 本研究擬通過(guò)糖尿病腎病大鼠模型，觀察DN大鼠腎皮質(zhì)ERS的變化規(guī)律，并觀測(cè)4-PBA對(duì)DN大鼠腎組織ERS及炎癥因子，纖維化的作用，探討4-PBA對(duì)DN的作用機(jī)制，為臨床防治DN 提供新思路。
　　 【研究方法】
　　 1.采用高糖高脂飲食+左腎切除+腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的

4、方法建立糖尿病腎病大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)、糖尿病腎病模型組(DN)和糖尿病腎病+4-PBA 治療組(DN+4-PBA)。各組大鼠分別于治療后第4、8和12周末進(jìn)行24h 尿量(UV)、尿蛋白排泄率(UPER)、血糖(Glu)、體質(zhì)量(BW)、腎質(zhì)量(KW)、腎質(zhì)量/體質(zhì)量(KI)、血肌酐(SCr)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)等的檢測(cè)。
　　 2.應(yīng)用HE及PAS 染色觀察DN大鼠腎組織病理改變，分析腎

5、小球面積(GA)、系膜/腎小球之比(FMA)。
　　 3.應(yīng)用ELISA 方法檢測(cè)DN大鼠腎皮質(zhì)單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)的活化情況。
　　 4.應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)DN大鼠腎皮質(zhì)p-PERK、p-JNK、p-IRS-1、MCP-1和Ⅰ型膠原(Co l Ⅰ)蛋白表達(dá)。
　　 5. 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法檢測(cè)DN大鼠腎皮質(zhì)GRP78、MCP-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和C

6、o l Ⅰ的mRNA表達(dá)。
　　 6. 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DN大鼠腎皮質(zhì)GRP78、MCP-1的表達(dá)分布情況。
　　 【研究結(jié)果】
　　 1.DN大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量、尿量、24h 尿蛋白排泄率及生化指標(biāo)的變化
　　 與NC組比較，在第4、8和12周末，DN組大鼠UV、UPER、KW、KI、SCr、TC、TG 均顯著升高(均P<0.05)，BW 顯著降低；與DN組比較，在第4、8和12

7、周末，DN+4-PBA組大鼠的UV、UPER、KW、KI 均顯著下降(均P<0.05)，BW 顯著增加(P<0.05)，SCr、TC、TG 無(wú)明顯降低(P>0.05)。這些結(jié)果表明，4-PBA能有效減少DN大鼠尿蛋白排泄、降低KW，KI和抑制DN大鼠的腎臟肥大，提示利用4-PBA 調(diào)節(jié)ERS 強(qiáng)度對(duì)DN大鼠有顯著的治療效果。
　　 2.DN大鼠腎臟組織ERS代表性分子的表達(dá)改變及4-PBA 治療作用
　　 與NC組相比，

8、DN組大鼠腎組織GRP78 mRNA 顯著增高(P<0.05)；跨膜蛋白PERK蛋白磷酸化表達(dá)顯著增加(P＜0.05)；GRP78在DN大鼠腎組織系膜區(qū)表達(dá)強(qiáng)度明顯增高。與DN組比較，DN+4-PBA組大鼠GRP78、p-PERK在腎組織的表達(dá)顯著下降，這些結(jié)果表明，DN大鼠腎臟存在ERS 激活。
　　 3.DN大鼠腎臟組織炎癥細(xì)胞因子表達(dá)變化
　　 與NC組相比，DN組大鼠腎組織MCP-1mRNA 顯著增高(P<0.0

9、5)；12周時(shí)，MCP-1在腎組織系膜區(qū)出現(xiàn)大量聚集；p-JNK蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；尿中MCP-1的分泌量顯著上升(P<0.05)；這些結(jié)果表明，DN大鼠體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)的激活，炎癥因子的表達(dá)異常。
　　 4.分子伴侶對(duì)DN大鼠腎臟組織炎癥細(xì)胞因子表達(dá)及病理的損傷的治療作用
　　 與DN組比較，DN+4-PBA組大鼠MCP-1mRNA與分泌量顯著降低(P<0.05)；p-JNK、TGF-β1、Co l Ⅰm

10、RNA在腎皮質(zhì)的表達(dá)明顯下降(P<0.05)；MCP-1在腎組織系膜區(qū)的表達(dá)顯著下降；DN組腎組織出現(xiàn)明顯基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，腎組織的GA和FMA 顯著高于NC組(P<0.05)；與NC組比較，DN+4-PBA組大鼠GA、FMA無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 這些結(jié)果表明，4-PBA 有效降低了DN大鼠的炎癥激活，減弱了腎臟纖維化程度，延緩了DN 進(jìn)展。
　　 5. 胰島素功能在糖尿病腎病大鼠的改變
　　 與NC組

11、比較，DN組大鼠Glu 逐漸升高(P<0.05)，腎組織p-IRS-1表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與DN組比較，DN+4-PBA組大鼠Glu呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，腎組織p-IRS-1蛋白水平顯著降低(P<0.05)；這些結(jié)果表明4-PBA 有效減低DN大鼠的高血糖，減弱腎組織胰島素抵抗，提示利用4-PBA 可緩解DN大鼠胰島素抵抗。
　　 【主要結(jié)論】
　　 1.糖尿病腎病形成過(guò)程中腎組織產(chǎn)生了典型的ERS，