滋補脾陰方藥對脾陰虛糖尿病腦病大鼠海馬內質網應激影響的研究.pdf

1、目的：糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組慢性血葡萄糖（簡稱血糖）水平增高為特征的代謝性疾病，是由千胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起的。2型糖尿病以胰島素抵抗為其特征。糖尿病可以引起多系統的損害，導致心臟、腎臟、神經、視網膜、血管等組織器官的慢性進行性改變，糖尿病腦?。╠iabetic encephalopathy，DE）是糖尿病慢性并發(fā)癥之一。其主要表現為輕中度的認知功能障礙、學習和記憶能力下降。研究表明，內質網

2、應激與糖尿病的發(fā)生存在著密切的關系。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細胞的一種應激反應過程，糖饑餓、鈣平衡紊亂、糖基化抑制、二硫鍵合成減少等情況下，內質網的微環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質折疊受到影響，導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質堆積于內質網內，由此引起未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）。UPR可以引起分子伴侶葡萄糖調節(jié)蛋白78 （glucose reg

3、ulated protein 78，GRP78）的活化，使其與抑制物阻抗性酯酶1（inositol-requiring enzyme，IRE1）、RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase， PERK）和活化的轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）解離，PERK與GRP78分離后低聚化和自身

4、磷酸化并使真核起始因子2的α亞單位（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）磷酸化，引起蛋白質翻譯抑制以減少新蛋白質的合成，阻止蛋白的進一步積聚。PERK和eIF2α磷酸化標志著內質網應激的發(fā)生。糖尿病腦病屬于中醫(yī)消渴病的合并癥，其病位在腦，涉及肝、腎、心、脾諸臟，病性多為本虛標實，陰虛燥熱。脾為后天之本，氣血生化之源，氣血為人體生命活動的物質基礎，脾虛一方面引起運化不足，水谷

5、精微和津液不能正常輸布排泄，積于體內，發(fā)為消渴；另一方面則引起氣血生化不足，腦髓失養(yǎng)，神機失調而發(fā)病。滋補脾陰方藥（ZBPYR）是戰(zhàn)麗彬教授根據吳澄《不居集》中資成湯化裁而成。為進一步探討ZBPYR對脾陰虛糖尿病腦病大鼠海馬內質網應激的影響，我們建立脾陰虛糖尿病腦病病證結合模型，應用ZBPYR進行干預，觀察模型大鼠學習記憶的行為學變化，并通過Western Blotting的方法探討ZBPYR對內質網應激相關蛋白表達的影響，旨在從蛋白水

6、平探討ZBPYR的新靶點，為糖尿病腦病的治療提供新的治療線索。 方法： 1.SPF級健康成年雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)3天，隨機分為空白對照組、脾陰虛組、糖尿病腦病組、脾陰虛糖尿病腦病組和脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR治療組，每組4只。 2.適應性喂養(yǎng)結束后，空白對照組和脾陰虛組仍以普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病腦病組、脾陰虛糖尿病腦病組和脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR治療組喂食高脂飼料，4周后大鼠按30mg/kg的標準一次性腹腔

7、注射1%的鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）溶液，建立糖尿病模型。72h后尾靜脈采血測量隨機血糖，隨機血糖>16.7mmol/L的大鼠確定為糖尿病模型。在STZ注射后的第4、8、12天分別檢測空腹血清胰島素水平（fasting serum insulin，FSI），進行口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT）和胰島素耐量實驗（insulin tolerance test，ITT）

8、。糖尿病模型成功建立后，在此基礎上通過疲勞過度加饑飽失常的復合因素造模的方法建立脾氣虛證模型，共18天。之后造模大鼠灌服傷陰藥，共9天，建立脾陰虛糖尿病腦病病證結合模型。脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR治療組大鼠給予ZBPYR治療，共16天。治療結束后斷頭取腦。造模期間觀察各組大鼠的體征變化。 3.通過跳臺實驗和Morris水迷宮實驗進行行為學測試，比較各組大鼠空間學習記憶能力的改變。 4.通過Western Blottin

9、g方法檢測各組大鼠海馬GRP78、PERK和eIF2α蛋白表達的變化。 結果： 1.STZ注射后糖尿病模型大鼠隨機血糖明顯高于非糖尿病模型大鼠（P<0.01）?？诜咸烟悄土繉嶒灲Y果表明糖尿病模型大鼠各時間點血糖均高于非糖尿病模型大鼠（P<0.05），且出現糖耐量異常；胰島素耐量實驗結果顯示糖尿病模型大鼠血糖降低速率比非糖尿病模型大鼠小，說明糖尿病模型大鼠存在胰島素抵抗現象?？崭寡逡葝u素水平糖尿病模型大鼠與非糖尿病模型

10、大鼠無明顯差異。 2.脾陰虛組表現出飲水量增加（P<0.01），肛溫升高（P<0.05）等陰虛內熱癥狀；行為學檢測結果顯示糖尿病腦病組和脾陰虛糖尿病腦病組學習記憶力降低（P<0.05）；脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR組學習記憶能力有所改善（P<0.05）。 3.Western Blotting結果顯示糖尿病腦病組、脾陰虛糖尿病腦病組大鼠海馬GRP78、磷酸化PERK、磷酸化eIF2α水平均明顯高于空白對照組和脾陰虛組（P<

11、0.05），脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR組與脾陰虛糖尿病腦病組相比GRP78、磷酸化PERK、磷酸化eIF2α水平明顯降低（P<0.05）。PERK、eIF2α總蛋白水平各組間沒有差異。 結論： 1.脾陰虛糖尿病腦病大鼠學習記憶障礙可能與內質網應激PERK信號途徑被啟動有關。 2.脾陰虛糖尿病腦病大鼠學習記憶障礙可能與大鼠海馬中GRP78蛋白水平增加、磷酸化PERK以及磷酸化eIF2α的表達增加有關。 3