FABP4通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)糖尿病腎病中系膜細(xì)胞的凋亡.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是目前我國(guó)乃至世界導(dǎo)致終末期腎病的一個(gè)主要原因。它的主要病理改變是系膜基質(zhì)增生、腎小球和腎小管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)積聚，最終出現(xiàn)腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化。越來(lái)愈多的研究表明腎臟固有細(xì)胞的凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。脂質(zhì)在腎小球或腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)沉積是包括DN在內(nèi)的許多腎臟疾病的常見(jiàn)

2、的病理變化，脂質(zhì)沉積造成細(xì)胞功能受損即所謂的“脂毒性”。但脂質(zhì)引起細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不清楚。游離脂肪酸(Free fattyacids，F(xiàn)FAs)，又稱非酯化脂肪酸，在循環(huán)血液中與白蛋白結(jié)合，DN患者血液中其含量明顯高于正常人。DN早期由于腎小球超過(guò)濾，F(xiàn)FAs隨白蛋白通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜進(jìn)入腎組織。FFAs不僅沉積在腎小球，也通過(guò)重吸收沉積在腎小管上皮細(xì)胞。脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acidbinding pro

3、tein，A-FABP/FABP4/aP2)是脂肪酸結(jié)合蛋白家族中最具特征的成員，作為FFAs的分子伴侶蛋白，通過(guò)與脂肪酸結(jié)合，促進(jìn)FFAs的轉(zhuǎn)運(yùn)，其表達(dá)量與FFAs的含量密切相關(guān)。但在腎組織的表達(dá)和意義尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是脂質(zhì)合成、蛋白質(zhì)折疊和成熟的重要細(xì)胞器，Ca+的耗竭、缺血、缺氧、錯(cuò)誤折疊及未折疊蛋白在腔內(nèi)的聚集均可影響ER的功能，繼而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endopla

4、smic reticulumstress，ERS)。ERS將激活體內(nèi)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded proteinresponse，UPR)，持續(xù)的UPR最終將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。雖然已經(jīng)證實(shí)DN存在ERS，但很多機(jī)制尚不完全清楚。
　　我們前期的研究結(jié)果證明：1型DM大鼠早期血清FFAs水平升高，DM大鼠早期腎皮質(zhì)FABP4的表達(dá)上調(diào)。本研究進(jìn)一步觀察人DN腎組織中FABP4的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2

5、的表達(dá)；試圖探討FABP4與ERS之間的關(guān)系。
　　本研究分為二部分：1、人腎活檢標(biāo)本的研究：采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)45例DN腎活檢組織中FABP4分布和表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)GRP78、Caspase-12和Bcl-2的表達(dá)；并定量分析上述指標(biāo)在腎小球中的表達(dá)變化；2、細(xì)胞學(xué)研究：給予人腎小球系膜細(xì)胞(Human mesangial cell，HMC)高糖和不同濃度的油酸(Oleic acids，OA)進(jìn)行干預(yù)，觀察HMC的超微形態(tài)學(xué)

6、變化，并檢測(cè)HMC中FABP4、GRP78、Caspase-12表達(dá)變化。
　　方法：
　　1人DN腎組織中FABP4、GRP78、Caspase-12和Bcl-2的分布、定位和定量分析
　　收集經(jīng)病理證實(shí)的DN腎活檢標(biāo)本45例作為病變組(DN組)，同時(shí)收集10例微小病變型腎病(minimal change glomerulonephropathy，MCGN)腎活檢標(biāo)本作對(duì)照組。HE、PAS染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；免疫組化

7、的方法檢測(cè)兩組腎活檢組織中FABP4及GRP78、Caspase-12和Bcl-2的表達(dá)，應(yīng)用Image-Pro-Plus5.0軟件進(jìn)行腎小球上述指標(biāo)定量分析，取統(tǒng)一放大倍數(shù)下DN組和MCGN組所有切片的腎小球進(jìn)行定量(完全硬化的腎小球剔除)。
　　2 HMC系在高糖和高OA條件下的的超微形態(tài)學(xué)變化和FABP4及GRP78、GADD153/CHOP、Caspase-12的表達(dá)特征分析
　　將分化成熟的系膜細(xì)胞分為5組：正常對(duì)

8、照組，高糖培養(yǎng)組(30mmol/1)和OA培養(yǎng)組(濃度分別為100μmol/1、200μmol/1、400μmol/1)。細(xì)胞同步化后進(jìn)行分組干預(yù)，分別于干預(yù)24、48h后收集各組細(xì)胞，掃描電鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；免疫細(xì)胞化學(xué)和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中FABP4、GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1人腎活檢結(jié)果分析
　?、貲N組的組織病理學(xué)分析

9、r>　　45例DN組腎活檢組織中，既有早期的變化如：腎小球肥大，彌漫性系膜基質(zhì)增生、腎小球基底膜增厚，部分腎小囊內(nèi)可見(jiàn)腎小囊滴，腎小球毛細(xì)血管袢可見(jiàn)纖維素帽狀病變；腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡和顆粒變性，腎小管基底膜增厚；又有晚期的病理改變?nèi)鐝浡阅I小球硬化及結(jié)節(jié)性硬化，結(jié)節(jié)性硬化可見(jiàn)典型的Kimmelstiel Wilson結(jié)節(jié)，呈局灶型分布。隨著病變進(jìn)展逐漸出現(xiàn)腎小管萎縮、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維化，小動(dòng)脈管壁增厚、玻璃樣變及管腔狹窄

10、。
　?、贔ABP4、GRP78、Caspase-12和Bcl-2的表達(dá)特征：免疫組織化學(xué)結(jié)果：MCGN組腎活檢組織FABP4在腎小球系膜細(xì)胞、個(gè)別毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和胞核表達(dá)；足細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。DN組可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)FABP4的系膜細(xì)胞數(shù)量增多。GRP78在MCGN組主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，部分腎小球系膜細(xì)胞和腎小囊壁層上皮細(xì)胞的胞漿也有表達(dá)。DN組GRP78表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮

11、細(xì)胞、系膜細(xì)胞及腎小囊壁層上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，在腎間質(zhì)炎細(xì)胞的胞漿中也有表達(dá)，且在系膜細(xì)胞和腎小囊壁層上皮細(xì)胞的表達(dá)量增加。Caspase-12在MCGN組表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞胞漿，腎小球系膜細(xì)胞和腎小囊壁層上皮細(xì)胞胞漿亦有表達(dá)，在DN組其表達(dá)明顯增強(qiáng)。Bcl-2在MCGN組表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、腎小囊壁層上皮細(xì)胞和部分腎小球系膜細(xì)胞的胞漿；在DN組腎間質(zhì)的淋巴細(xì)胞胞漿可見(jiàn)到Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)；系膜細(xì)胞和腎小囊壁層上皮細(xì)胞

12、的表達(dá)量減少。
　?、勰I小球中FABP4、GRP78、Caspase-12和Bcl-2表達(dá)的定量分析：DN組腎小球FABP4、GRP78和Caspase-12的表達(dá)均高于MCGN組(P＜0.05)，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)低于MCGN組(P＜0.05)。
　　2培養(yǎng)人系膜細(xì)胞系結(jié)果分析FABP4及ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)和含量改變
　?、俨煌深A(yù)條件下HMC超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析：掃描電鏡觀察，正常對(duì)照組HMC之間通過(guò)長(zhǎng)長(zhǎng)的偽足相互聯(lián)

13、系；與對(duì)照組相比，HG組系膜細(xì)胞體積增大，核仁明顯，亦由偽足相互連接，細(xì)胞表面出現(xiàn)分泌小泡；OA組HMC細(xì)胞明顯皺縮，體積縮小，偽足消失，細(xì)胞表面分泌小泡增多。
　　透射電鏡觀察，與對(duì)照組相比，HG組細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴，線粒體腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)自噬泡；與對(duì)照組相比OA組細(xì)胞表面微絨毛減少、脫落，細(xì)胞漿內(nèi)脂滴增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫脹。
　?、诿庖呒?xì)胞化學(xué)結(jié)果：對(duì)照組系膜細(xì)胞，F(xiàn)ABP4表達(dá)量較少，HG、OA組與對(duì)照組相比，表達(dá)量

14、明顯增加，且OA組細(xì)胞皺縮，體積縮小，偽足消失。GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12在細(xì)胞的胞漿和胞核均有表達(dá)，對(duì)照組表達(dá)較弱，高糖及高OA刺激后表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　③Western Bolt結(jié)果：培養(yǎng)24h和48h的HMC，與對(duì)照組相比，HG組和OA組其FABP4、GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12表達(dá)均高于對(duì)照組；與刺激24h的HMC相比，HG和OA刺激48h的細(xì)胞FABP4表達(dá)量

15、下降，GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12表達(dá)量增加；OA組不同濃度間上述幾個(gè)指標(biāo)的表達(dá)量未見(jiàn)差別。
　　結(jié)論：
　　1 DN患者腎活檢組織腎小球的FABP4、GRP78和Caspase-12表達(dá)增高，Bcl-2表達(dá)減少，說(shuō)明①DN的腎小球系膜細(xì)胞FABP4的表達(dá)上調(diào)；②DN存在ERS；③DN持續(xù)的ERS抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)系膜細(xì)胞的凋亡。④我們的結(jié)果為DN腎小球硬化性病變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。