原發(fā)性膽汁性膽管炎模型鼠腹腔B細(xì)胞調(diào)節(jié)性功能機(jī)制探究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種自身免疫性肝臟疾病，它的典型特征是肝臟有大量淋巴細(xì)胞浸潤在膽管周圍，并且血清中有高滴度的由自身反應(yīng)性B細(xì)胞分泌的抗線粒體抗體AMAs。有很多因素參與到PBC的發(fā)病過程中，包括免疫失調(diào)、遺傳的易感性以及環(huán)境因素等。已有的研究指出B細(xì)胞在PBC的發(fā)病過程中的作用十分復(fù)雜，根據(jù)情況不同，可能發(fā)揮致病性作用或者免疫調(diào)節(jié)性功能。但是其具體機(jī)制尚不清楚，仍然需要進(jìn)一步研究和探索。
　　B細(xì)胞是一類重要的免疫細(xì)

2、胞，主要分為2個(gè)亞群，即B1細(xì)胞（包含B1a細(xì)胞和B1b細(xì)胞）和B2細(xì)胞。這兩個(gè)B細(xì)胞亞群在前體細(xì)胞來源、發(fā)育途徑、組織分布、表型及功能等方面存在差異。在自身免疫性疾病發(fā)生過程中，一般認(rèn)為B細(xì)胞通過分泌抗體發(fā)揮致病性作用。但最近的研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞除了包含發(fā)揮致病性功能的亞群，同時(shí)還具有免疫調(diào)節(jié)性功能的亞群。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg細(xì)胞)發(fā)揮功能的機(jī)制主要包括產(chǎn)生IL-10和TGF-β、參與次級(jí)抗原遞呈、與致病性T細(xì)胞相互作用以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T

3、細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的產(chǎn)生等。B1細(xì)胞是一個(gè)特殊的B細(xì)胞亞群，大量存在于腹腔及胸腔中，主要通過分泌天然抗體、作為抗原遞呈細(xì)胞以及分泌細(xì)胞因子來發(fā)揮免疫保護(hù)作用。B1細(xì)胞來源的天然抗體在細(xì)菌和病毒感染過程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。B1a細(xì)胞是腹腔B1細(xì)胞中的主要亞群，B1a細(xì)胞經(jīng)典的功能包括產(chǎn)生血清中靜息狀態(tài)的IgM、分泌腸道IgA以及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能等。B1a細(xì)胞是抗炎性細(xì)胞因子IL-10的主要來源，并且在接觸性超敏反應(yīng)模型以及病理?xiàng)l件下能

4、夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)性功能。
　　為了更好的闡明B細(xì)胞亞群在PBC發(fā)病進(jìn)程中的作用，我們以p40-/-IL-2Rα-/-小鼠以及被廣泛研究的dnTGF-βRⅡ小鼠作為PBC的模型鼠展開研究。本論文主要探究了p40-/-IL-2Rα-/-小鼠中腹腔B1a細(xì)胞的紊亂與自身免疫性膽管炎的關(guān)系，同時(shí)利用dnTGF-βRⅡ小鼠腹腔B細(xì)胞的共轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)對(duì)模型鼠中腹腔B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)性功能進(jìn)行驗(yàn)證。目前取得的結(jié)果如下:
　　1.p40-/-IL-

5、2Rα-/-模型鼠腹腔微環(huán)境改變影響腹腔B細(xì)胞數(shù)目并與肝臟炎癥具有相關(guān)性
　　為了探究p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠肝臟損傷時(shí)腹腔微環(huán)境的變化，通過檢測(cè)腹腔中各細(xì)胞亞群數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)模型鼠中腹腔總細(xì)胞數(shù)目顯著增多，且增多的主要是T細(xì)胞，尤其是致病性的CD8+T細(xì)胞，而B細(xì)胞數(shù)目顯著減少。進(jìn)一步研究表明模型鼠腹腔CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌Th1型炎性細(xì)胞因子IFN-γ的能力顯著增強(qiáng)。通過檢測(cè)腹腔灌洗液中炎性細(xì)胞因子的水平，我

6、們發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子TNF和MCP-1水平顯著升高，這可能是導(dǎo)致腹腔各細(xì)胞亞群改變的原因。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)模型鼠中腹腔總細(xì)胞數(shù)與肝臟單個(gè)核細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，腹腔中B1a細(xì)胞占B細(xì)胞的比例與腹腔及肝臟單個(gè)核細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)，且腹腔中B1a細(xì)胞占B細(xì)胞的比例與腹腔及肝臟中致病性的CD8+T細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)。
　　2.p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔B1a細(xì)胞數(shù)目減少且功能性分子改變
　　通過對(duì)PBC模型鼠發(fā)病過程中腹腔

7、B細(xì)胞的詳細(xì)檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照鼠，模型鼠腹腔B1a及B1b細(xì)胞的比例和數(shù)目顯著降低，而且模型鼠腹腔B1a細(xì)胞的比例隨著年齡增長逐漸降低。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明模型鼠腹腔B1a細(xì)胞增殖能力顯著降低且凋亡水平顯著升高。模型鼠腹腔B1a細(xì)胞數(shù)目顯著減少的同時(shí)，與B1a細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)性功能相關(guān)分子，包括IL-10，CTLA-4和GITR的表達(dá)水平都顯著下降;與B1a細(xì)胞活化及免疫共刺激相關(guān)分子CD44和CD80的表達(dá)水平明顯降低。通過對(duì)另一種

8、PBC模型鼠，即dnTGF-βRⅡ小鼠的表型檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)與p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠類似，dnTGF-βRⅡ小鼠腹腔B1a細(xì)胞比例下降，且表達(dá)IL-10、CTLA-4、CD44和CD80的水平同樣顯著低于同窩對(duì)照鼠。
　　3.p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔B1a細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　為了全面探究p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔B1a細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化及其內(nèi)在機(jī)制，利用基因芯片技術(shù)并配合熒光定量PCR

9、驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照鼠相比，模型鼠腹腔B1a細(xì)胞有381個(gè)基因發(fā)生了顯著變化（2倍以上差異），其中包含大量細(xì)胞因子及其受體相互作用相關(guān)、轉(zhuǎn)錄因子活化相關(guān)及細(xì)胞周期相關(guān)基因的變化。且多個(gè)與B細(xì)胞功能相關(guān)的基因都發(fā)生了顯著改變，其中具有免疫抑制性基序(ITIM)的分子CD72（Cd72）、CD22(Cd22)等表達(dá)顯著上升，與流式結(jié)果一致的Cd44、Ctla4等表達(dá)顯著下降，以及IL-10的上游抑制分子AHR(Ahr)等表達(dá)顯著上升。這些發(fā)

10、現(xiàn)詳細(xì)地展示了模型鼠與對(duì)照鼠腹腔B1a細(xì)胞存在的差異，揭示了B1a細(xì)胞異常在PBC發(fā)病過程中的重要作用機(jī)制，并提示了一些在人類PBC研究中值得參考的基因和信號(hào)通路。
　　4.PBC模型鼠腹腔B細(xì)胞對(duì)自身免疫性膽管炎治療潛力的評(píng)估
　　為了探討PBC模型鼠腹腔B細(xì)胞對(duì)膽管炎是否具有治療潛能，我們進(jìn)一步利用過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單轉(zhuǎn)輸dnTGF-βRⅡ模型鼠脾臟CD8+T細(xì)胞能引起RAG1-/-受體鼠肝臟產(chǎn)生嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤，而將d

11、nTGF-βRⅡ模型鼠腹腔B細(xì)胞或WT鼠腹腔B細(xì)胞與dnTGF-βRⅡ模型鼠脾臟CD8+T細(xì)胞共轉(zhuǎn)輸，發(fā)現(xiàn)RAG1-/-受體鼠肝臟淋巴細(xì)胞浸潤都有所減輕。該實(shí)驗(yàn)為證明PBC模型鼠腹腔B細(xì)胞在炎性條件下具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能提供了有利的證據(jù)。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在炎性環(huán)境下，p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠中腹腔B1a細(xì)胞顯著減少，且B1a細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)性功能紊亂，分泌免疫調(diào)節(jié)性分子IL-10和表達(dá)CTLA-4的水平顯著降低，