肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素在大鼠內(nèi)毒素肺損傷中作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)急危重癥之一，感染是該病的主要誘因，革蘭氏陰性桿菌感染致ALI，主要是由于內(nèi)毒素（Endotoxin）的主要成分脂多糖（Lipopolysacharide，LPS）活化炎性細(xì)胞釋放大量炎癥細(xì)胞因子所致。肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，Ams）是呼吸道的重要防線，亦是LPS的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究其LPS 致傷作用的

2、信號(hào)通路及阻斷效應(yīng)，對(duì)幫助了解ALI的發(fā)生機(jī)制，尋找ALI 治療的新靶位，具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 核仁素是一種穿梭蛋白，它可以自由穿梭于細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞膜之間，它參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，并在病原微生物的感染和自身免疫系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮一定的作用。
　　 核仁素可以幫助病原微生物粘附于宿主細(xì)胞并進(jìn)入宿主細(xì)胞，這使核仁素成為抗微生物感染的新的治療靶點(diǎn)。目前，有研究報(bào)道，在外周血的單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞膜表面也有核仁

3、素表達(dá)和分布，并參與了LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α和 IL-6的產(chǎn)生和釋放，其具體的信號(hào)傳導(dǎo)途徑尚未闡明。Ams是來(lái)源于外周血的單核細(xì)胞，核仁素在其細(xì)胞膜表面是否有表達(dá)，以及是否參與了LPS對(duì)Ams的激活尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 本研究旨在通過(guò)檢測(cè)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面核仁素的表達(dá)分布變化，觀察膜核仁素與LPS的相互作用，探討膜核仁素在LPS 激活A(yù)ms中的作用，初步闡明其在LPS 致急性肺損傷中的作用及機(jī)制。
　　

4、方法：
　　 1．檢測(cè)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素的表達(dá)采用支氣管肺泡灌洗法分離獲得大鼠肺泡巨噬細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光激光共聚焦法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面核仁素的表達(dá)。
　　 2．觀察肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素與LPS 相互作用應(yīng)用親和層析法，制備LPS的親和層析柱，分離純化與LPS 結(jié)合的肺泡巨噬細(xì)胞膜結(jié)合蛋白。ELISA 法檢測(cè)LPS與核仁素的結(jié)合反應(yīng)。采用雙重免疫熒光法，用FITC標(biāo)記的LPS 以及Cy3 標(biāo)記的核

5、仁素抗體共同孵育肺泡巨噬細(xì)胞，觀察二者在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。流式細(xì)胞術(shù)分析核仁素抗體對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞結(jié)合LPS的影響。
　　 3．LPS 誘導(dǎo)下肺泡巨噬細(xì)胞核仁素的基因和膜蛋白表達(dá)變化用RT-PCR和Western blot的方法分別檢測(cè)LPS 誘導(dǎo)下肺泡巨噬細(xì)胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白在不同時(shí)相點(diǎn)上的表達(dá)變化。用RT-PCR和Western blot 法分別檢測(cè)不同濃度的LPS 誘導(dǎo)下肺泡巨噬細(xì)胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白

6、的表達(dá)變化。
　　 4．體外轉(zhuǎn)染核仁素RNAi表達(dá)載體對(duì)LPS 激活肺泡巨噬細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究分離、培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，在LPS 刺激前予以轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA。免疫熒光及激光共聚焦觀察LPS內(nèi)化入肺泡巨噬細(xì)胞情況。Western blot 檢測(cè)膜核仁素蛋白表達(dá)。EMSA 檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB 活性。ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α和 IL-6表達(dá)。
　　 5．體內(nèi)轉(zhuǎn)染核仁素RNAi表達(dá)載體對(duì)

7、LPS 肺損傷大鼠肺泡巨噬細(xì)胞活化的影響SD大鼠麻醉后行氣管插管，氣管內(nèi)滴入pBS-U6.C23shRNA，對(duì)照組滴入pBS-U6.controlshRNA，48h后予以尾靜脈注射LPS，復(fù)制急性肺損傷模型。取左下肺行HE 染色。肺泡灌洗分離培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞，Western blot 檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素蛋白表達(dá)；EMSA 檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB 活性；ELISA 檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-α和 IL-6表達(dá)。
　　 結(jié)果

8、
　　 1．成功分離培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)均觀察到大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面有核仁素表達(dá)。
　　 2．通過(guò)親和層析法分離純化得到LPS 膜結(jié)合蛋白核仁素，膜核仁素可以與LPS 直接結(jié)合，ELISA 檢測(cè)顯示二者的結(jié)合反應(yīng)呈濃度依賴性增加。同時(shí)，運(yùn)用雙重?zé)晒夤捕ㄎ环ㄓ^察到核仁素與LPS 1h后共定位于細(xì)胞膜上，4h后共定位于細(xì)胞漿內(nèi)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗核仁素的抗體顯著抑制了LPS與肺泡巨噬細(xì)胞結(jié)合。<

9、br>　　 3．正常未受刺激的細(xì)胞即可見(jiàn)核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表達(dá)。1ug/ml的LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞，1h后核仁素的mRNA表達(dá)開(kāi)始升高，4h 達(dá)到高峰，隨后逐漸減弱；
　　 膜核仁素的蛋白表達(dá)2h 開(kāi)始升高，8h 達(dá)到高峰，12h后逐漸下降。用不同濃度的LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組核仁素的mRNA和膜核仁素蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而且隨著LPS濃度的增加，其表達(dá)呈濃度依賴性增強(qiáng)，當(dāng)LPS濃度達(dá)到1

10、00ug/ml時(shí)，繼續(xù)增加LPS的濃度，核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表達(dá)不再增加。
　　 4．LPS 刺激后的未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA對(duì)照組的細(xì)胞膜核仁素蛋白的表達(dá)、LPS的內(nèi)化、NF-κB的活性以及上清液中TNF-α和 IL-6的含量均較未刺激細(xì)胞增強(qiáng)(P<0.01)；轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA組的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA組相比，以上指標(biāo)均明顯降低(P<0.0

11、1)。
　　 5．氣道內(nèi)轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA 或pBS-U6.controlshRNA 48h后，大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好。LPS 肺損傷模型建立后行肺泡灌洗，與對(duì)照組相比，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA組的肺病理?yè)p傷、肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素的蛋白表達(dá)、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和 IL-6的含量均顯著升高(P<0.01)；轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA組肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素的蛋白表

12、達(dá)明顯下調(diào)，干擾效果達(dá)72％；
　　 肺病理?yè)p傷評(píng)分、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和 IL-6的含量均明顯低于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA組(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1．正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面表達(dá)有核仁素，LPS 可以增強(qiáng)核仁素mRNA和膜核仁素蛋白的表達(dá)。
　　 2．肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素可能是LPS的一種新的膜結(jié)合受體，它參與了LPS的內(nèi)化。