IRF5調(diào)控的肺泡巨噬細(xì)胞極化在SAP肺損傷中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　(1)建立重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷小鼠模型，確定肺損傷程度最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)。
　　(2)闡明肺泡巨噬細(xì)胞極化與SAP肺損傷之間的關(guān)系。
　　(3)研究干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)在肺泡巨噬細(xì)胞極化調(diào)控中的作用。
　　(4)進(jìn)一步探討體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中慢病毒介導(dǎo)的IRF5干擾(IRF5 shRNA)對(duì)SAP肺損傷的干預(yù)作用。
　　方法:
　　(1) SAP肺損傷小鼠模型的建立及肺損傷程度的評(píng)估:

2、雨蛙素聯(lián)合脂多糖腹腔注射制備SAP肺損傷小鼠模型，通過(guò)胰腺、肺組織病理學(xué)評(píng)分，血清淀粉酶、肺組織濕干重比(W/D)、肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性、丙二醛(MDA)含量、TNF-α和IL-1β檢測(cè)等方法證實(shí)建模成功并進(jìn)行肺損傷程度評(píng)估，進(jìn)一步確定小鼠肺損傷最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)。
　　(2)肺泡巨噬細(xì)胞極化與SAP肺損傷之間的關(guān)系:通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)SAP肺損傷小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞及其它炎癥細(xì)胞的含量。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞相

3、關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法及激光共聚焦免疫熒光染色法觀察肺泡M1、M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與肺損傷之間的關(guān)系。
　　(3)研究IRF5在肺泡巨噬細(xì)胞極化調(diào)控中的作用:通過(guò)流式細(xì)胞儀分選出肺泡M1、M2型巨噬細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IRF5在肺泡M1、M2型巨噬細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)。IRF5小干擾RNA(IRF5 siRNA)轉(zhuǎn)染肺泡M1型巨噬細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、Western blottin

4、g檢測(cè)轉(zhuǎn)染后M1、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志性分子mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，鑒定其極化狀態(tài)的變化。
　　(4)IRF5 shRNA對(duì)SAP肺損傷保護(hù)作用的研究:制備慢病毒介導(dǎo)的IRF5干擾病毒，并確定干擾效果最顯著的序列作為后續(xù)IRF5基因的干擾片段。將IRF5 shRNA通過(guò)尾靜脈注射感染小鼠，24h后建模，通過(guò)肺組織病理學(xué)評(píng)分，血清淀粉酶、肺組織濕干重比、MPO活性、MDA含量測(cè)定、TNF-α、IL-1β檢測(cè)和免疫組織化學(xué)染色法、

5、激光共聚焦免疫熒光染色法等方法評(píng)價(jià)肺組織損傷程度，檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變，評(píng)價(jià)IRF5 shRNA對(duì)SAP肺損傷是否有保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　(1)成功建立了SAP肺損傷小鼠動(dòng)物模型，確定了SAP建模后48h為小鼠急性肺損傷最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)。
　　(2)肺泡巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)同SAP肺損傷具有密切的聯(lián)系。肺損傷早期（SAP后24h），此時(shí)處于炎癥進(jìn)展期，以M1型肺泡巨噬細(xì)胞占據(jù)優(yōu)勢(shì);肺損傷后期（SAP后96h

6、），炎癥逐漸過(guò)渡到修復(fù)期，M2型肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多。
　　(3) IRF5在肺泡M1型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于肺泡M2型巨噬細(xì)胞，有顯著性差異（P＜0.01）。IRF5 siRNA轉(zhuǎn)染肺泡M1型巨噬細(xì)胞后，TNF-α、IL-12、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量較未處理M1型巨噬細(xì)胞顯著降低，有顯著性差異（P＜0.01）。IL-10、Arg-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)未處理M1型巨噬細(xì)胞明顯增加，有顯著性差異（P＜0.01），

7、與未處理M2型巨噬細(xì)胞比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。IRF5 siRNA轉(zhuǎn)染肺泡M1型巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換。
　　(4) IRF5 shRNA組同生理鹽水組及Scramble shRNA組比較，肺損傷程度明顯減輕。肺泡M1型巨噬細(xì)胞明顯減少，M2型巨噬細(xì)胞顯著增多，肺泡巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)由M1向M2轉(zhuǎn)換。
　　結(jié)論:重癥急性胰腺炎建模后48h為小鼠急性肺損傷程度最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)。肺損傷早期階段，