脂肪干細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷大鼠保護(hù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性加重的呼吸困難，難治性低氧血癥和肺水腫。ALI進(jìn)一步進(jìn)展可導(dǎo)致更嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。40％-50％患者系感染或膿毒血癥所致。目前尚無有效的治療方法，其死亡率高達(dá)40％。ALI/ARDS主要病理改變包括毛細(xì)血管膜損傷、通透性增

2、加而導(dǎo)致大量蛋白和炎癥細(xì)胞因子的滲出;肺泡上皮細(xì)胞的損害導(dǎo)致富含蛋白質(zhì)的水腫液及透明膜形成，并伴有肺間質(zhì)的纖維化，由此導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降、通氣/血流比例失衡.
　　肺泡液體清除率(AFC)與肺水腫密切相關(guān)，在一定程度上可以作為肺水腫患者預(yù)后評(píng)判的重要指標(biāo)。呼吸功能正常的肺損傷患者，肺泡液體清除率高者機(jī)械通氣時(shí)間短，反之則機(jī)械通氣時(shí)間延長(zhǎng)。肺水清除率高的急性肺損傷患者預(yù)后也好。肺泡內(nèi)液體清除以肺上皮細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主。肺泡上皮的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)

3、系統(tǒng)主要由鈉離子通道(epithelial Na+ channels，ENaC)、Na+-K+-ATP酶和水通道蛋白(Aquaporin，AQPs)組成。AQPs是一組對(duì)水特異性通透的膜蛋白，使水通過生物膜的速度超過自由彌散速度。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物肺組織的AQPs主要有6種即AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5、AQP-8、AQP-9，分別表達(dá)于肺組織的不同部位，參與肺臟不同部位的水分子轉(zhuǎn)運(yùn)，在維持肺內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及液體平衡中起到重

4、要的作用。水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）是廣泛分布于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種細(xì)胞膜蛋白，主要清除支氣管和脈管周圍組織的水分，而AQP-5主要存在于肺泡上皮細(xì)胞，主要功能是清除肺泡腔內(nèi)的水分[13]。
　　脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose Derived Stromal Cells，ADSCs)是一種來源于脂肪可以向中胚層多種細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多能干細(xì)胞，因其取材簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，少量脂肪組織即可獲取大量細(xì)胞，

5、體外培養(yǎng)方便，擴(kuò)增容易而倍受研究者的關(guān)注，而且體外研究指出ADSCs可以分泌大量的促血管新生的細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)等。將ADSCs用于缺血性疾病取得了滿意的結(jié)果，更有研究將該種細(xì)胞用于肺損傷模型，如肺氣腫的動(dòng)物模型，依靠ADSCs的多向分化功能和/或其分泌作用增加肺組織的血管

6、及腺泡的生成和修復(fù)，從而改善了肺組織的血流灌注和換氣功能。
　　本研究以ADSCs為研究重點(diǎn)，通過研究肺組織水通道蛋白及肺水清除率的變化，探討其對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的影響，研究ADSCs對(duì)肺損傷治療的可能機(jī)制。
　　材料和方法：
　　雄性成年SD大鼠購于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重220-250g，腹腔注射0.25％戊巴比妥鈉40mg/kg實(shí)施腹腔麻醉。
　　實(shí)驗(yàn)一:于嚴(yán)格無菌條件下取大鼠腹股溝脂肪組織

7、，剪碎后用膠原酶消化，反復(fù)過濾離心獲取ADSCs;ADSCs通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定、成脂誘導(dǎo)油及紅O染色和成骨誘導(dǎo)及茜素紅染色進(jìn)行表型和功能鑒定。取大鼠肺組織，采用組織塊法分離肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVEC)，體外培養(yǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)，通過內(nèi)皮細(xì)胞vWF免疫熒光鑒定和異植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。所有細(xì)胞均反復(fù)進(jìn)行表型和功能鑒定，確保所獲得細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞。肺上皮細(xì)胞系(A549)購買自中科院上海細(xì)胞庫。將PMVEC或A549細(xì)胞105個(gè)接種于

8、Transwell上室，ADSCs0.5×105個(gè)接種Transwell下兩室，加入LPS10ug/ml，6小時(shí)后收集上清液，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;ELISA法檢測(cè)TNF-α，IL-1β及IL-8的表達(dá);western blotting檢測(cè)NF-κB、Caspase-3、AQP1及AQP5蛋白水平變化。
　　實(shí)驗(yàn)二:雄性SD大鼠220-250g，隨機(jī)分為三組:對(duì)照組（C組;n=12），10％水合氯醛，0.35ml/100g麻

9、醉后，0.5h內(nèi)頸靜脈泵注等量的生理鹽水2ml;脂多糖組（LPS組;n=12），0.5h內(nèi)頸靜脈泵注含有LPS10mg/kg的生理鹽水2ml;細(xì)胞組（A組;n=12），0.5h內(nèi)頸靜脈泵注含有LPS10mg/kg的生理鹽水1ml后，將第三代CM-DIL標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞1*106[39]個(gè)容于1ml生理鹽水泵注。三組均在第48h處死，檢測(cè)AFC;取血離心留取上清檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-8;留取右肺上葉置于10％中性甲醛固定做HE

10、染色及免疫組化;取中葉肺組織放入-80℃，待Western blot和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè);左肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗并測(cè)定干濕比;按照同樣分組方式，每組15只大鼠單獨(dú)進(jìn)行生存分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一:1、大鼠腹股溝脂肪組織經(jīng)過膠原酶消化后，72小時(shí)細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，原代細(xì)胞分離種植后7-10天融合至90％左右可以傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，約2-3天即可再次傳代。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面免疫表型，CD29，

11、CD90，CD105陽性，CD14，CD45基本陰性。油紅染色鑒定成脂誘導(dǎo)14天后的細(xì)胞可見細(xì)胞漿內(nèi)脂滴染成紅色，茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo)14天的ADSCS，細(xì)胞變長(zhǎng)，聚集，細(xì)胞漿可見棕紅色的鈣化沉積顆粒。分離的PMVECs表現(xiàn)為典型的鋪路石樣，長(zhǎng)至融合狀態(tài)后呈現(xiàn)單層生長(zhǎng)和接觸抑制的特性;免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Ⅷ及異植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)陽性。
　　2、ADSCs與PMVECs或A549共培養(yǎng)后，減少了上清液中TNF-α，IL-1β及IL

12、-8的產(chǎn)生(P＜0.01);降低了NF-κB、Caspase-3蛋白的表達(dá)下降(P＜0.01)，但增加AQP1及AQP5蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。
　　實(shí)驗(yàn)二:ADSCs移植后可定位于肺組織，通過肺組織熒光照片可以觀察到CM-DIL標(biāo)記的ADSCs在肺組織中大量存在。與LPS組相比，ADSCs組明顯改善肺組織的病理學(xué)改變，ADSCs組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-8明顯降低(P＜0.05)，肺組織中NF-κB、Casp

13、ase-3基因和蛋白的表達(dá)下降(P＜0.01)，AQP1及AQP5基因與蛋白的表達(dá)增加(P＜0.01);肺水清除率改善;最終治療組大鼠的生存率明顯改善。
　　結(jié)論：
　　1、脂肪干細(xì)胞對(duì)體外LPS損傷的PMVECs及A549細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。
　　2、脂肪干細(xì)胞移植降低了TNF-α、IL-1β和IL-8的表達(dá)，降低肺損傷評(píng)分，具有抗炎的作用。
　　3、脂肪干細(xì)胞移植能抑制NF-κB及Caspase-3的表達(dá)，