植物特異性小GTP結(jié)合蛋白Rab5b在氣孔保衛(wèi)細胞中的功能.pdf

1、小GTP結(jié)合蛋白是一個很大的蛋白超家族，存在于所有的真核生物中，其功能依賴GTP的水解，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子開關(guān)。Rab蛋白是小G蛋白超家族中最大的一個家族，參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各個細胞器及內(nèi)膜系統(tǒng)的運輸。Rab5亞類蛋白在動物細胞中的功能是調(diào)節(jié)內(nèi)吞小泡的形成、靶向運輸和融合，是調(diào)節(jié)內(nèi)吞速率的關(guān)鍵因子。在植物中，也發(fā)現(xiàn)Rab5蛋白與內(nèi)吞和胞內(nèi)小泡運輸?shù)恼{(diào)節(jié)相關(guān)，但Rab5b蛋白在保衛(wèi)細胞中的功能尚未闡明。 本論文對水稻OsRab5b及煙

2、草NtRab5b在煙草氣孔保衛(wèi)細胞中的功能進行了初步研究，并在構(gòu)建植物表達載體時發(fā)現(xiàn)植物表達基因一農(nóng)桿菌章魚堿合成酶ocs基因的終止子在原核生物中具有啟動子活性。本研究取得以下結(jié)果： 為了獲得OsRab5b蛋白的多克隆抗體，在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達GST-OsRab5b融合蛋白，并用GSTrap柱進行純化，得到高純度的融合蛋白，并以此作為抗原，免疫新西蘭白兔，取血清檢測效價，獲得效價為1：5000的抗血清。再用Protei

3、n-A/CL-4B樹脂親和層析純化抗血清，得到濃度為1.5μg/μ1的抗體。 為了研究水稻OsRab5b蛋白在煙草保衛(wèi)細胞中的功能，首先在煙草中過量表達OsRab5b，通過westernblot檢測，篩選出高表達量的轉(zhuǎn)基因株系。與非轉(zhuǎn)基因株系相比較，OsRab5b過量表達轉(zhuǎn)基因株系的葉片易萎蔫，經(jīng)過葉片的生理分析和葉表皮的細胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在逆境條件下，的氣孔關(guān)閉延遲而導(dǎo)致較高的蒸騰速率，使葉片過度失水而產(chǎn)生萎蔫。用ABA誘導(dǎo)非

4、轉(zhuǎn)基因株系和過量表達轉(zhuǎn)基因株系葉片的下表皮，非轉(zhuǎn)基因株系的氣孔在ABA誘導(dǎo)下正常關(guān)閉，而過量表達轉(zhuǎn)基因株系的氣孔失去了對ABA的敏感性。向過量表達OsRab5b的轉(zhuǎn)基因植株中導(dǎo)入RNA干涉載體，經(jīng)western檢測，證實轉(zhuǎn)基因植株中的OsRab5b的表達發(fā)生沉默，沉默轉(zhuǎn)基因株系所表現(xiàn)各種現(xiàn)象均與非轉(zhuǎn)基因株系一致。用熒光染料FMl-43標記葉的下表皮細胞膜，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察氣孔保衛(wèi)細胞的內(nèi)吞作用。在ABA的誘導(dǎo)下，煙草和蠶豆的氣

5、孔保衛(wèi)細胞在關(guān)閉過程中，內(nèi)吞作用明顯加速；而用高滲透壓代替ABA時，內(nèi)吞加速不如ABA誘導(dǎo)顯著。ABA處理轉(zhuǎn)基因煙草，非轉(zhuǎn)基因株系與沉默轉(zhuǎn)基因株系的保衛(wèi)細胞正常關(guān)閉，并伴隨著內(nèi)吞作用明顯加速；而過量表達株系的內(nèi)吞作用明顯變慢，而且氣孔關(guān)閉不嚴。這說明OsRab5b在煙草中過量表達阻礙氣孔保衛(wèi)細胞的正常內(nèi)吞作用，從而使氣孔關(guān)閉受阻。 本研究利用植物特異性Rab5b蛋白具有保守區(qū)的特點，采用Clustalw軟件將四種植物特異性Ra

6、b5b蛋白(百脈根LiRab5b、龍船海棠McRab5b、擬南芥Ara6和水稻OsRab5b)進行多重序列比較，找到保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)置引物，從煙草中擴增到一段400bp的片段，經(jīng)測序分析，該序列與其它植物特異性Rab5bcDNA的同源性很高。采用RT-PCR和3’RACE方法獲得其全長cDNA編碼區(qū)。經(jīng)軟件分析，該cDNA所編碼的蛋白具有植物特異性Rab5b的特點，因此，命名為NtRab5b。將植物特異性Rab5b與植物Rab5

7、a及動物Rab5蛋白的序列進行了比較，發(fā)現(xiàn)煙草NtRab5b蛋白具Rab蛋白家族的共性，即有Rab特異序列(YYRGA)，四個與GTP結(jié)合相關(guān)的功能基序(GB1-GB4)，一個與其蛋白效應(yīng)子相結(jié)合的效應(yīng)子基序(AIB)，這些基序都是Rab蛋白行使功能所需的。但與人及動物不同的是，植物特異性Rab5b的C末端缺乏與膜結(jié)合的基序，而在N末端有類似異源三體G蛋白α亞基N端的與膜結(jié)合的功能基序。采用SWISS-MODEL程序進行同源建模的結(jié)果表

8、明，煙草NtRab5b和水稻OsRab5b的三維結(jié)構(gòu)相似，但與LjRab5b有較大的差異。 進一步研究了OsRab5b-GFP和NtRab5b-GFP及各自的突變體-GFP融合蛋白在煙草保衛(wèi)細胞中的亞細胞定位情況，對Rab5b的功能進行了初步的分析。利用生物學(xué)軟件對水稻和煙草的兩種植物特異性Rab5b蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)它們的N端有葉綠體導(dǎo)肽功能的可能性。將NtRab5b及OsRab5b及其突變體NtRab5b(G2A)及OsR

9、ab5b(G2A)與GFP融合后，轉(zhuǎn)化煙草，觀察融合蛋白在保衛(wèi)細胞中的定位。結(jié)果表明：四種融合蛋白都能與細胞質(zhì)膜結(jié)合，而GFP不與細胞膜結(jié)合，提示植物特異性Rab5b蛋白很可能參與保衛(wèi)細胞的內(nèi)吞過程。NtRab5b-GFP位于葉綠體和細胞質(zhì)中，OsRab5b-GFP融合蛋白只進入到葉綠體中，這與軟件預(yù)測的結(jié)果一致；而NtRab5b(G2A)-GFP與OsRab5b(G2A)-GFP融合蛋白卻都不能進入到葉綠體中，說明植物特異性Rab5b

10、蛋白的N端與蛋白質(zhì)能否進入葉綠體有關(guān)，具有葉綠體導(dǎo)肽的功能。在ABA誘導(dǎo)作用下，煙草氣孔保衛(wèi)細胞中過量表達NtRab5b和NtRab5b-GFP時，氣孔能正常關(guān)閉，保衛(wèi)細胞內(nèi)吞作用正常加速，與未轉(zhuǎn)基因煙草的氣孔開關(guān)行為一致；而過量表達NtRab5b(G2A)、NtRab5b(G2A)-GFP、OsRab5b和OsRab5b-GFP及OsRab5b(G2A)-GFP的氣孔保衛(wèi)細胞內(nèi)吞作用受阻，氣孔的關(guān)閉也受到影響。這些結(jié)果表明，植物特異性

11、Rab5b蛋白N端第2位氨基酸是該蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用所必需的，NtRab5b參與調(diào)節(jié)ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過程中的內(nèi)吞作用。 另外，在構(gòu)建植物表達載體過程中發(fā)現(xiàn)一個在植物中表達的農(nóng)桿菌章魚堿合成酶(ocs)基因的終止子在原核生物中具有啟動子功能，并對其啟動子活性進行了系統(tǒng)地研究。已知的農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)基因都在植物冠癭瘤細胞中表達，與冠癭瘤的形成有關(guān)。將ocs基因3’區(qū)約800bp的片段與報告基因hptⅡ和gusA連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌

12、和農(nóng)桿菌后，進行了潮霉素抗性分析和熒光定量分析后發(fā)現(xiàn)ocs基因3’區(qū)有原核啟動子活性，但比CaMV35S啟動子的活性要弱。將帶有報告基因的表達載體轉(zhuǎn)入到煙草中進行分析時發(fā)現(xiàn)，ocs基因3’區(qū)不具有真核啟動子活性。利用生物學(xué)軟件分析ocs基因3’區(qū)的下游至T-DNA區(qū)右邊界的序列，發(fā)現(xiàn)在其下游存在一個編碼142個氨基酸的開放閱讀框架ORF12，它與ocs基因編碼鏈部分互補重疊。對野生型農(nóng)桿菌進行了RT-PCR分析，表明ORF12基因在農(nóng)桿