BCR特異性和信號強度在B10細胞發(fā)育中的作用.pdf

1、免疫應(yīng)答的調(diào)控一直是免疫學(xué)領(lǐng)域的研究重點，其中負向免疫調(diào)控近年來尤其受到重視。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells）的發(fā)現(xiàn)及其功能的闡明大大豐富了人們對免疫應(yīng)答及免疫耐受的認識，并且已在臨床諸多學(xué)科產(chǎn)生重要影響。對于B細胞，我們通常認為其通過產(chǎn)生抗體、提供協(xié)同刺激信號而發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用，但實際上B細胞也具有重要的負向免疫調(diào)節(jié)功能。1996年，Janeway等人在B細胞缺陷小鼠（μMT小鼠）誘導(dǎo)EAE，出現(xiàn)更嚴重的臨床癥

2、狀，并且進行性加重，首次明確了調(diào)節(jié)性B細胞的存在和功能。1997年Bhan等將μMT小鼠與自發(fā)產(chǎn)生結(jié)腸炎的TCRα鏈敲除小鼠（TCRα-/-小鼠）交配，子代小鼠出現(xiàn)腸炎的癥狀更早且更嚴重，表明B細胞在T細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有重要的抑制作用，據(jù)此研究者提出了“調(diào)節(jié)性B細胞”的概念。之后又在I型糖尿病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、接觸性皮炎等多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的小鼠模型中驗證了B細胞負向免疫調(diào)節(jié)功能的存在。此外，在變態(tài)反

3、應(yīng)、腫瘤免疫、抗感染免疫，B細胞也發(fā)揮了重要的負向免疫調(diào)節(jié)作用。
　　2008年Tedder研究組首次在正常小鼠脾臟中鑒定出了一個調(diào)節(jié)性B細胞亞群，其表型為CD5+CD1dhighCD19+，由于其負向免疫調(diào)節(jié)功能依賴于IL-10，為區(qū)別于其他可能存在的調(diào)節(jié)性B細胞亞群，將這一調(diào)節(jié)性B細胞亞群命名為B10細胞。B10細胞的鑒定是調(diào)節(jié)性B細胞研究領(lǐng)域的重要進展，為進一步研究其功能和發(fā)育特點奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　BCR是B細胞

4、發(fā)育過程中的核心分子，其特異性和信號強度對B細胞的發(fā)育具有關(guān)鍵性的作用。B10細胞作為B細胞的一個亞群，盡管其功能不同于普通的B細胞，但BCR仍然是其發(fā)育和發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。本研究選擇B10細胞的產(chǎn)生機制這一關(guān)鍵問題，從BCR信號強度和特異性的角度進行深入研究。我們前期工作中建立了表面BCR密度不同的2系能夠識別自身抗原的BCR轉(zhuǎn)基因小鼠-TgVH3B4，我們利用2系TgVH3B4小鼠分析了BCR識別自身抗原的特異性和信號強度對小鼠B

5、10細胞發(fā)育的影響，給予TgVH3B4小鼠和轉(zhuǎn)基因陰性小鼠皮下注射自身抗原Actin和外來抗原OVA，分析識別不同抗原的BCR特異性對B10細胞的誘導(dǎo)作用，并且在不同體外刺激下對小鼠脾細胞進行培養(yǎng)，分析強度不同的BCR刺激和CD40等刺激對B10細胞活化和成熟的作用。
　　主要實驗方法：
　　1）用anti-CD19磁珠分選WT小鼠脾臟CD19+ B細胞，流式細胞儀進一步分選CD5+CD1dhighCD19+B細胞和CD5-

6、CD19+B細胞，在預(yù)包被keratin、actin、myosin、PC、LPC、LPS和OVA等7種抗原的96孔ELISPOT板中進行培養(yǎng)，每孔加入1.5×105個細胞培養(yǎng)48 h，分析CD5+CD1dhighCD19+ B細胞和CD5-CD19+ B細胞中識別自身抗原和外來抗原的細胞數(shù)；
　　2）取WT小鼠、11＃、39# TgVH3B4小鼠脾臟、腹腔細胞，流式細胞儀分析不同小鼠脾臟中CD5+CD1dhighCD19+B細胞比

7、例，不加任何刺激或LPS+PIM刺激5 h的情況下，PE/Cy5-anti-CD19細胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10細胞內(nèi)染色，流式細胞儀分析脾臟和腹腔CD19+IL-10+B細胞比例；
　　3）TgVH3B4小鼠脾細胞體外培養(yǎng)5 h，給予LPS+PIM刺激，分別用PE/Cy5-anti-CD19和Biotin-anti-IgMa/Avidin-FITC或PE/Cy5-anti-CD19和FITC-actin細

8、胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10細胞內(nèi)染色，流式細胞儀分析 IgMa+、Actin+B細胞中IL-10的表達；
　　4）WT小鼠脾臟細胞體外培養(yǎng)5 h，分別給予PIM、LPS+PIM、soluble anti-IgM mAb、coated anti-IgM mAb等對細胞進行刺激，PE/Cy5-anti-CD19細胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10細胞內(nèi)染色，流式細胞儀分析CD19+IL-10+B

9、細胞比例，明確B10細胞活化的信號特點；
　　5）WT小鼠脾臟細胞體外培養(yǎng)48 h，分別給予LPS、soluble anti-IgM mAb、coated anti-IgM mAb、anti-CD40 mAb(IgG)或anti-CD40 mAb(IgM)進行體外刺激，以及采用anti-CD40 mAb(IgG)+soluble anti-IgM mAb、anti-CD40 mAb(IgG)+coated anti-IgM mAb

10、、anti-CD40 mAb(IgM)+soluble anti-IgM mAb、anti-CD40 mAb(IgM)+coated anti-IgM mAb等不同的聯(lián)合刺激方案對細胞進行體外刺激，最后5 h加入 PIM， PE/Cy5-anti-CD19細胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10細胞內(nèi)染色，流式細胞儀分析CD19+IL-10+B細胞表達情況；
　　6）WT小鼠、2系TgVH3B4小鼠皮下注射Actin、

11、OVA，40μg/ml，每周1次，共3次，間隔1周后取小鼠外周血，ELISA分析小鼠外周血抗-Actin和抗-OVA IgG表達水平；同時取小鼠脾細胞， PE/Cy5-anti-CD19、PE-anti-CD5、Biotin-anti-CD1d/Avidin-FITC染色，流式細胞儀分析小鼠脾臟CD5+CD1dhighCD19+B細胞的變化。
　　主要研究結(jié)果和結(jié)論：
　　野生C57BL/6小鼠脾臟CD5+CD1dhighC

12、D19+B細胞亞群中識別自身抗原keratin、myosin、actin、LPC、PC的細胞數(shù)明顯高于CD5-CD19+B亞群；而識別外來抗原LPS、OVA的細胞數(shù)在CD5+CD1dhighCD19+B細胞亞群和CD5-CD19+B細胞亞群中無明顯差異。
　　TgVH3B4小鼠脾臟CD5+CD1dhighCD19+B細胞比例明顯升高，在不加任何刺激和LPS+PIM5 h刺激的情況下，其脾臟和腹腔CD19+IL-10+B細胞比例也明

13、顯升高，且這種變化趨勢在表面BCR密度較高的39系轉(zhuǎn)基因小鼠更加明顯。
　　轉(zhuǎn)基因IgMa+B細胞亞群中IL-10的表達明顯高于IgMa-B細胞亞群；能夠識別自身抗原Actin的Actin+B細胞亞群中IL-10的表達也明顯高于Actin-B細胞亞群；皮下注射Actin可進一步誘導(dǎo)TgVH3B4小鼠脾臟CD5+CD1dhighCD19+B細胞的擴增，而給 TgVH3B4小鼠注射 OVA或給轉(zhuǎn)基因陰性小鼠注射 Actin均不會誘導(dǎo)小

14、鼠脾臟CD5+CD1dhighCD19+B細胞的擴增。
　　在體外刺激5 h時，能夠更有效誘導(dǎo)BCR交聯(lián)的coated anti-IgM mAb刺激有利于B10細胞的活化并促進B細胞CD5分子的表達；體外刺激48 h時，coated anti-IgM mAb刺激對B細胞表達IL-10具有抑制作用，且對CD40信號誘導(dǎo)B10pro細胞成熟的抑制作用更強。
　　本研究明確了小鼠B10細胞具有識別自身抗原的特異性，識別自身抗原對B