抑制PARP-1及iNOS表達在大鼠心肌梗死后心功能保護中的作用研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　一、抑制PARP-1及iNOS表達在大鼠心肌梗死后心功能保護中的作用研究
　　目的：
　　1.探討PARP1、iNOS對大鼠心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響;
　　2.探討PARP1、iNOS的抑制劑對大鼠心肌梗死后心功能的保護作用;
　　3.進一步探討PARP1、iNOS的抑制劑對心梗后心功能保護作用的可能分子機制。
　　方法：
　　1.動物分組及藥物處置

2、　　每組10只雄性Wistar大鼠，麻醉后給予冠狀動脈前降支結(jié)扎，造成心梗模型，根據(jù)分組分別給予不同的抑制劑腹腔注射。分為假手術(shù)對照組（Control）、心梗手術(shù)組(MI)、PARP抑制劑組(DPQ)、iNOS抑制劑組(1400W)共四組。
　　2.監(jiān)測各組大鼠基本指標
　　實驗過程中于造模前及處死前后各測1次心率、體重、血壓。
　　3.超聲心動圖評價心臟結(jié)構(gòu)與功能
　　分別在術(shù)后3天、2周和4周時麻醉大鼠，應(yīng)用

3、小動物經(jīng)胸2維超聲采集心功能各項指標，重點測量反應(yīng)左室收縮功能的指標:左室收縮末期內(nèi)徑(ESD)、左室舒張末內(nèi)徑(EDD)、縮短分數(shù)(FS)=((EDD-ESD)/EDD)×100，取多次測量多組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計統(tǒng)計。
　　4.Caspase活性檢測
　　選取凋亡相關(guān)的Caspase因子進一步評價心梗相關(guān)區(qū)域的心肌細胞凋亡，參照Caspase-3因子的活性試劑盒使用說明測定反應(yīng)后吸光光密度值反應(yīng)活性大小。
　　5.活性性氧

4、及其產(chǎn)物測定
　　購買DHE染色試劑盒，按照染色步驟對實驗動物取材后石蠟切片進行DHE探針標記細胞中超氧陰離子的產(chǎn)生。
　　6.免疫組織化學染色
　　取心肌組織石蠟切片，分別免疫組化檢測左室心肌組織PAR因子、3-硝基酪氨酸(3-NT)及vWF因子的表達，并進行綜合分析。
　　7.實時定量RT-PCR基因水平檢測
　　取-80℃凍存的心肌組織，Trizol法提取心肌組織總RNA，實時定量RT-PCR技術(shù)檢測

5、各指標的表達水平。
　　8.Western blot檢測
　　取-80℃保存的心肌組織，提取總蛋白，Western-Blot檢測左室心肌組織內(nèi)裂解的Caspase3片段、裂解的PARP片段以及與血管發(fā)生相關(guān)的因子vWF等的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠的一般情況比較
　　整個實驗中共死亡5只，最終35只大鼠完成實驗。其中，Control組10只;MI組7只;MI+ DPQ組9只;MI+1400W組9只

6、。實驗開始時，各組大鼠心率、體重和血壓均無差異(P＞0.05)。實驗結(jié)束時，各組與對照組比較，體重無明顯下降(P＞0.05);心梗后心率、血壓升高(P＜0.05)，而藥物干預(yù)后的兩組與對照組比較，心率、血壓升高程度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　2.超聲測量心臟結(jié)構(gòu)和功能指標的變化
　　MI組與對照組比較，LVIDs及LVIDd均顯著擴大(P＜0.05);藥物干預(yù)后的兩組與MI組比較，LVIDs及LVIDd均明顯減小(P

7、＜0.05)。MI組與對照組比較，F(xiàn)S、LVEF均不同程度降低(P＜0.05);藥物干預(yù)后的兩組與MI組比較，F(xiàn)S、LVEF均不同程度升高(P＜0.05)。
　　3.TUNEL染色觀察PARP抑制劑(DPQ)和iNOS抑制劑(1400W)對梗死心肌組織細胞凋亡發(fā)生率的影響.
　　4.PARP抑制劑(DPQ)和iNOS抑制劑(1400W)對Caspase活性的影響。
　　5.PARP1、iNOS抑制劑組大鼠PARP和iN

8、OS的表達減少。
　　6.PARP和iNOS抑制劑組大鼠缺血梗死心肌組織損傷性活性氧及其產(chǎn)物硝基酪氨酸的表達降低。
　　7.PARP和iNOS抑制劑組大鼠梗死相關(guān)區(qū)域的新生血管vWF表達增加。
　　結(jié)論：
　　1.PARP和iNOS的過度激活與心肌細胞凋亡、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)， DPQ和1400W可以有效的抑制心肌缺血壞死誘發(fā)的PARP和iNOS的激活。
　　2.PARP和iNOS抑制劑能夠減少凋亡相關(guān)因子的

9、表達，能夠減少缺血部位的過氧化亞硝酸鹽的產(chǎn)生，抑制過氧化反應(yīng)，從而減少細胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，增加新生血管，保護心臟功能。
　　3.PARP抑制劑和iNOS抑制劑可降低心梗大鼠左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)及左室舒張末內(nèi)徑((LVIDd)，提高縮短分數(shù)(FS)，顯示PARP抑制劑和iNOS抑制劑明顯改善心梗大鼠心室重構(gòu)，改善心臟功能。
　　二、PARP-1和iNOS的表達水平與心功能不全評價指標的相關(guān)性研究
　　目的：<

10、br>　　基于PARP-1及iNOS的產(chǎn)生和生物學功能的研究基礎(chǔ)，我們著重觀察了它們與心衰患者嚴重程度的臨床評估標準之間的相關(guān)性的關(guān)系，進一步驗證其在心衰進展中的作用。
　　方法：
　　1.實驗對象及選擇
　　選取2011年2月至2013年8月期間山東大學第二醫(yī)院心臟內(nèi)科住院治療的心功能不全患者，臨床評價其心功能為NYHAⅡ-V級，經(jīng)心臟彩超測定左室射血分數(shù)＜50％，或免疫檢測血BNP＞100ng/ml。對照組（n=3

11、2例）為心功能正常人群，無心功能不全癥狀，臨床檢測左室射血分數(shù)＞50％且血BNP＜100ng/ml。
　　2.各指標測量標準
　　記錄所納入患者的性別、年齡、體重、身高;測量心率、血壓等;入院前服用地高辛、ACEI/ARB、β受體阻滯劑及利尿劑等口服藥物情況。入院后均予以檢測血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，行心電圖、心臟彩

12、超、胸片等相關(guān)檢查，檢測BNP、CRP、ESR、心肌酶等。
　　研究對象血壓測定方法為:清晨醒來后在未進行任何肢體活動前測量左上臂血壓，每日測定1次，取測得收縮壓(SBP)平均值作為血壓指標;按照體重(kg)/身高(m)2計算體重指數(shù)(BMI)。
　　心臟超聲心動圖的測定由有經(jīng)驗的超聲醫(yī)師完成，選擇胸骨旁左心長軸切面測量EDD、ESD，、LVEF、LA、MRA。取連續(xù)3個心動周期所測量的各結(jié)果的平均值為研究數(shù)據(jù)。
　　

13、3.實驗方法
　　(1)周圍靜脈血血漿的分離保存:采集各研究對象清晨空腹時肘靜脈血3ml，注入枸櫞酸鈉(EDTA)抗凝的血液收集器內(nèi)，低溫離心吸取上清，分裝于EP管快速凍存于-80℃冰箱。
　　(2)白細胞的分離:清晨采集靜脈血于抗凝管內(nèi)，人外周血白細胞分離液分離后常溫離心，微量取樣器吸出第二層白細胞富集層，緩沖液清洗后快凍存于-80℃保存。
　　(3)血漿內(nèi)BNP的檢測步驟（酶聯(lián)免疫吸附法）:血漿BNP的測定使用雙抗

14、體夾心ELISA法測定。
　　(4)細胞中PARP-1及iNOS蛋白表達的檢測采用Weston-blot法。
　　(5)細胞中PARP-1及iNOS基因表達的檢測采用RT-PCR檢測。
　　結(jié)果：
　　1.臨床檢測指標對比顯示，與對照組相比，心功能不全患者與對照組之間體重指數(shù)(BMI)、血紅蛋白、心率、血糖、血脂(TG、TC、LDL-C、HDL-C)等指標無明顯統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），而血壓(SBP)水平在

15、心功能不全(Ⅳ級)組較對照組減低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.各組間心臟彩超及BNP檢測結(jié)果與心功能不全分級的關(guān)系:與對照組相比，心功能不全患者EDD、ESD及LVEF等心臟彩超檢測數(shù)值均有統(tǒng)計學差異，且LVEF明顯降低(P＜0.05); BNP濃度明顯升高(P＜0.05)。其中LVEF與心功能不全的相關(guān)系數(shù)R2=0.9676(P＜0.01)，BNP濃度與心功能不全的相關(guān)系數(shù)R2=0.8796(P＜0.01)。

16、r>　　3.不同組PARP1及iNOS基因表達與心功能不全分級的關(guān)系:心功能不全組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組）PARP1及iNOS基因表達明顯升高(P＜0.05); PARP1基因相對表達與心功能分級之間呈正相關(guān)(R2=0.7919,P＜0.05);iNOS基因相對表達與心功能分級之間也呈正相關(guān)（R2=0.6737,P＜0.05）。
　　4.不同組白細胞內(nèi)PARP1及iNOS蛋白水平與心功能不全分級的關(guān)系:與對照組相比，心功能不全組（Ⅱ、Ⅲ、

17、Ⅳ組）PARP1及iNOS蛋白相對表達明顯升高(P＜0.05);PARP1及iNOS相對蛋白表達與心功能分級之間呈正相關(guān)(R2=0.973, R2=0.7696, P＜0.05)。
　　5.各組PARP1及iNOS表達與LVEF的相關(guān)性分析:不管是基因還是白細胞內(nèi)蛋白水平的相對表達量檢測，均提示PARP1及iNOS表達均與LVEF水平呈明顯負相關(guān)(P＜0.05)。
　　6.各組PARP1及iNOS表達與BNP的相關(guān)性分析:不

18、同組PARP1及iNOS相對表達量與BNP的濃度之間呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.無論基因水平還是蛋白質(zhì)水平的結(jié)果提示:心功能不全患者血中PARP-1及iNOS表達水平較健康人群表達量均顯著升高。
　　2.PARP-1及iNOS表達水平升高與心功能不全的分級有顯著的正相關(guān)性;且與BNP表達水平呈正相關(guān)，與心臟彩超測定的心功能呈負相關(guān)。
　　3.PARP-1及iNOS的表達水平升高參與心衰的發(fā)生，