腦靶向樹(shù)枝狀高分子納米基因遞釋系統(tǒng)的研究.pdf

1、基因治療是許多腦部疾病極具潛力的治療手段。由于治療基因本身、病毒載體或未經(jīng)修飾的非病毒載體無(wú)法自主跨越血腦屏障(BBB)到達(dá)腦部,目前腦部基因?qū)氲闹饕椒ㄊ悄X實(shí)質(zhì)直接定位注射,該方法傷害大,難以實(shí)施多次給藥,且基因產(chǎn)物蛋白很難轉(zhuǎn)運(yùn)到腦的廣泛范圍。特異性修飾的非病毒載體有可能經(jīng)血管途徑給藥,以非侵襲性方式實(shí)現(xiàn)外來(lái)基因藥物在腦部的廣泛表達(dá),但其基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)的效率普遍較低。探索具有腦靶向性且高效表達(dá)的非病毒基因載體,實(shí)現(xiàn)經(jīng)血管給藥達(dá)到腦部

2、外源性基因的廣泛表達(dá),成為目前腦部疾病基因治療領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。
　　 本課題通過(guò)藥劑學(xué)、高分子學(xué)和生物學(xué)手段的交叉應(yīng)用,對(duì)載體高分子、腦靶向頭基進(jìn)行比較和篩選后最終構(gòu)建了一種新型高效的腦靶向非病毒納米基因遞釋系統(tǒng)。該系統(tǒng)以陽(yáng)離子高分子聚酰胺-胺(PAMAM)為基礎(chǔ)載體高分子,通過(guò)親水性高分子聚乙二醇(PEG)連接新型腦靶向頭基乳鐵蛋白(Lf),與基因復(fù)合形成PAMAM-PEG-Lf/DNA納米粒。該納米粒具有以下兩大特性:

3、(1)利用腦部表達(dá)Lf相關(guān)受體的特征,采用Lf作為腦靶向頭基修飾載體高分子,增加納米粒的腦靶向性;(2)所采用的基因載體PAMAM是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型陽(yáng)離子高分子材料,易于修飾,載基因能力較高。
　　 本文第一章首先進(jìn)行高分子材料的篩選,比較了殼聚糖(CH)、聚乙烯亞胺(PEI)和不同代數(shù)PAMAM的基因包載效率、不同納米粒體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCECs)的效率等性質(zhì)。瓊脂糖凝膠電泳和DNA含量測(cè)定(PicoG

4、reen分析)結(jié)果顯示,各載體高分子與DNA的質(zhì)量比達(dá)到一定值時(shí),各載體高分子可完全包封DNA,復(fù)合形成的納米粒均有一定抵抗外界陰離子物質(zhì)的置換作用,能保護(hù)所包載DNA免受DNase的降解并保持DNA的完整性。熒光顯微鏡和熒光素酶定量分析結(jié)果顯示,第5代PAMAM(PAMAMG5)/DNA納米粒的表達(dá)效率較高。綜合文獻(xiàn)報(bào)道,PAMAMG5可較好平衡基因轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性等各方面因素,本課題最終采用PAMAMG5為高分子載體。
　　

5、 選定了基礎(chǔ)載體高分子后,本文第二章先采用經(jīng)典腦靶向頭基轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)通過(guò)PEG修飾PAMAM,構(gòu)建了PAMAM-PEG-Tf.UV-vis、1H-NMR和SDS-PAGE結(jié)果顯示載體高分子PAMAM-PEG-Tf合成成功。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)攝取納米粒的結(jié)果表明,PAMAM-PEG-Tf的細(xì)胞攝取效率在較低濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性,在高濃度時(shí)有飽和趨勢(shì)。并且,125I放射性標(biāo)記PAMAM后各載體高分子的體內(nèi)分布結(jié)果顯示,

6、經(jīng)Tf修飾后的載體高分子在腦組織的分布量約為單純PAMAM的2.25倍。制備的PAMAM-PEG-Tf/DNA納米粒,其粒徑在200nm左右,zeta電位在13mV左右,電鏡觀察顯示納米粒呈球形,表面圓整光滑,具有良好的穩(wěn)定性。經(jīng)Tf修飾后,納米粒在BCECs和腦內(nèi)的表達(dá)均顯著高于未修飾的納米粒。但是,Tf作為腦靶向頭基存在一定局限性,如Tf受體介導(dǎo)的雙向跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)功能可能降低通過(guò)Tf受體介導(dǎo)入腦的納米粒在腦內(nèi)的濃集量、生理狀態(tài)下。B

7、BB上大部分Tf受體可能被內(nèi)源性Tf占據(jù)而降低納米粒腦靶向性等,需要尋找新的高效的腦靶向頭基用于基因遞釋系統(tǒng)的構(gòu)建,提高載基因納米粒的腦靶向性和腦內(nèi)基因表達(dá)效率。
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,Lf具有優(yōu)于Tf和抗Tf受體單克隆抗體OX26的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率,提示Lf有可能成為更好的腦靶向頭基。但目前關(guān)于腦部Lf受體的表征主要是在體外BBB模型上,尚無(wú)關(guān)于腦組織Lf受體表征的報(bào)道,本文第三章對(duì)原代培養(yǎng)BCECs和小鼠腦組織上的Lf受體進(jìn)行表征

8、。共聚焦顯微鏡和結(jié)合動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Lf與其受體的結(jié)合具有飽和性和競(jìng)爭(zhēng)抑制現(xiàn)象。結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腦部Lf受體存在高低兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),低濃度時(shí)主要和高結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,高濃度時(shí)才進(jìn)一步與低結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。Lf與BCECs表面高低結(jié)合位點(diǎn)的Kd值分別為6.77nM和4815nM;與腦細(xì)胞膜上高低結(jié)合位點(diǎn)的Kd值分別為10.61nM和2228nM。
　　 綜合第三章研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)可見(jiàn),Lf作為腦靶向頭基具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì),包括:Lf受

9、體介導(dǎo)的跨BBB單向轉(zhuǎn)運(yùn)功能更利于Lf修飾的納米基因遞釋系統(tǒng)在腦組織濃集、生理狀態(tài)下血循環(huán)中Lf的低濃度使內(nèi)源性Lf不會(huì)大量占據(jù)腦細(xì)胞膜上Lf相關(guān)受體等。本文第四章首次采用Lf為腦靶向頭基,考察Lf修飾的載體高分子PAMAM-PEG-Lf及其載基因納米粒的體內(nèi)外性質(zhì)。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,PAMAM-PEG-Lf的細(xì)胞攝取效率在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性,在高濃度時(shí)有飽和趨勢(shì)。并且,在相同濃度比較時(shí),PAMAM-PEG-Lf的

10、細(xì)胞攝取和腦內(nèi)分布高于PAMAM-PEG-Tf,而其他組織的分布量顯著下降。在此基礎(chǔ)上制備了PAMAM-PEG-Lf/DNA納米粒,其粒徑在210nm左右,zeta電位在25mV左右,電鏡觀察顯示納米粒呈球形,表面圓整光滑,同時(shí)透射電鏡下觀察到納米粒表面的膠體金顆粒,證實(shí)了納米粒表面存在數(shù)十個(gè)Lf分子。與Tf修飾的納米粒比較,經(jīng)Lf修飾后的納米粒在BCECs和小鼠腦內(nèi)的表達(dá)均顯著提高。納米粒體內(nèi)基因表達(dá)分布結(jié)果顯示,PAMAM-PEG-

11、Lf/DNA納米粒的腦內(nèi)基因表達(dá)量約為PAMAM-PEG-Tf/DNA納米粒的2.3倍,而全身其他器官的基因表達(dá)降低,顯示了Lf作為腦靶向頭基的優(yōu)越性。
　　 由于Lf首次作為腦靶向頭基、載體高分子PAMAM-PEG-Lf為本課題首次合成,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道,該載體高分子及其載基因納米粒的入腦機(jī)制尚不清楚,本文第五章對(duì)此進(jìn)行了探討。細(xì)胞攝取抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PAMAM-PEG-Lf保留了PAMAM的高分子特性和Lf的配體-受體結(jié)合性

12、質(zhì),可以經(jīng)多種途徑包括網(wǎng)格蛋白有被小窩和細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷依賴性內(nèi)吞途徑以及巨胞飲途徑被原代培養(yǎng)BCECs攝取;PAMAM-PEG-Lf載體高分子及其載基因納米粒主要通過(guò)受體介導(dǎo)的穿細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程跨越BBB,但仍保留了吸附介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。另外,經(jīng)葉綠素銅腦內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAMAM-PEG-Lf/DNA納米粒可跨越BBB進(jìn)入腦組織。
　　 最后,因文獻(xiàn)報(bào)道帕金森病(PD)患者腦部神經(jīng)元和微血管上Lf受體表達(dá)顯著增加,本文第六章以PD為疾

13、病模型,評(píng)價(jià)了PAMAM-PEG-Lf包載編碼人源性膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的治療基因(hGDNF)的納米粒在急性、慢性PD模型大鼠上的藥效,設(shè)計(jì)了多次給藥方案,并比較了單次、多次靜脈給藥后的治療效果,未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。結(jié)果表明,單次給藥時(shí),PAMAM-PEG-Lf/hGDNF納米粒的腦部基因表達(dá)最高,且隨時(shí)間會(huì)降低;多次給藥可以持續(xù)增加納米粒的腦內(nèi)基因表達(dá),5次給藥的表達(dá)量顯著高于單次給藥或3次給藥,證實(shí)了多次給藥的可行性和有

14、效性。同時(shí),在6-OHDA單側(cè)損毀急性模型上,多次給藥組能顯著改善阿樸嗎啡誘導(dǎo)的PD癥狀,明顯增加紋狀體和黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目,同時(shí)還提高了損毀側(cè)多巴胺(DA)及其代謝產(chǎn)物的量,接近未損毀側(cè)的水平,顯示出其優(yōu)越性。在魚(yú)藤酮慢性模型上,多次給予PAMAM-PEG-Lf/hGDNF納米粒同樣顯示出優(yōu)于單次給藥的療效,多次給藥能顯著改善PD大鼠的行動(dòng)能力,提高酪氨酸羥化酶(TH)免疫反應(yīng)性,同時(shí)提高紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物的水平。以上實(shí)