應(yīng)用樹枝狀高分子載體靶向基因治療前列腺癌的實驗研究.pdf

1、近年來我國的前列腺癌發(fā)病率逐年升高。對于局部和全身轉(zhuǎn)移的進展期患者，臨床尚無較好的治療方法。基因治療自上個世紀九十年代初用于腫瘤的治療研究以來，被認為是治療包括前列腺癌等惡性實體腫瘤最有前途的方法。但現(xiàn)階段基因治療腫瘤的發(fā)展正受一些技術(shù)難點的困擾，其中缺乏在體內(nèi)安全、有效的基因載體問題是瓶頸之一。本研究先以第5代陽離子聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(Generation 5 Polyamidoamine Dendrimers，G5-PAMAM

2、-D)為基因載體，載含自殺基因HSV-tk和表達小發(fā)卡RNA(shRNA)的質(zhì)粒，在體內(nèi)外進行實驗性治療研究，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)對G5-PAMAM-D進行修飾，獲得具有前列腺癌靶向性的載體G5-PAMAM-D-Tf，再以PAMAM-D-Tf為載體攜表達 shRNA的質(zhì)粒進行靶向前列腺癌的組織特異性RNA干擾治療研究。為前列腺癌的基因治療尋找安全、高效、并有靶向性的基因載體。 第一部分:G5-PAMAM-D 介導HS

3、V-tk/GOV系統(tǒng)對前列腺癌生長的抑制 目的：考察PAMAM-D作為自殺基因HSV-tk/GCV系統(tǒng)載體進行前列腺自殺基因治療的可行性。 方法：以第5代PAMAM-D(G5-PAMAM-D)為載體將含增強型熒光蛋白(EGFP)基因片段的質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染至前列腺癌細胞系PC-3和22Rvl，成功表達EGFP后，再以 G5-PAMAM-D將含HSV-tk自殺基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3-tk轉(zhuǎn)染至前列腺癌細胞系P

4、C-3和22Rvl，轉(zhuǎn)染48h后，對轉(zhuǎn)染的兩種細胞給予不同濃度的前體藥更昔洛韋(Ganciclovir,GCV)，24h后采用MTT比色法測定藥物對細胞增殖的影響。制作前列腺癌皮下荷瘤小鼠模型，將G5-PAMAM-D/pcDNA3-tk復合物瘤內(nèi)注射，24h后腹腔注射GCV，觀察這一復合物體內(nèi)對腫瘤生長的抑制作用。 結(jié)果：熒光觀察及FCM結(jié)果證明G5-PAMAM-D可將pEGFP-C1轉(zhuǎn)入2種前列腺癌細胞并表達EGFP。采用G5

5、-PAMAM-D將pcDNA3-tk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3和22Rvl細胞，給不同濃度的前體藥GCV后，實驗組細胞與對照組相比有明顯濃度依賴性生長抑制，說明PAMAM-D作為載體可在體外將HSV-tk自殺基因遞送至前列腺癌細胞中，并在細胞中進行表達，從而使HSV-tk/GCV 自殺基因系統(tǒng)發(fā)揮殺傷細胞的作用。荷瘤小鼠模型在給予瘤內(nèi)注射G5-PAMAM-D/pcDNA3-tk，行腹腔注射GCV治療后第40天，治療組腫瘤體積與2個對照組相比腫瘤生

6、長明顯被抑制(P<0.01)，生存時間延長。 結(jié)論：G5-PAMAM-D可做為前列腺腺癌自殺基因治療的基因載體，有良好的應(yīng)用前景。 第二部分:PAMAM-D介導STAT3-shRNA對前列腺癌生長的抑制作用 目的：考察G5-PAMAM-D作為小發(fā)卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表達質(zhì)粒的載體，進行前列腺癌RNA干擾基因治療的可行性。 方法：根據(jù)增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和

7、信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)cDNA序列結(jié)構(gòu)分別設(shè)計構(gòu)建表達EGFPmRNA、STAT3mRNA 特異的shRNA 真核表達質(zhì)粒pSilencing4,1-EGFP-shRNA和pSilencing4.1-STAT3-shRNA。在體外以G5-PAMAM-D為載體將質(zhì)粒pEGFP-C1和pSilencing4.1-EGFP-shRNA共轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞 PC-3、22Rvl，通過觀察EGFP表達反映干擾效果以及轉(zhuǎn)染效率。再以同

8、樣的方式將pSilencing4.1-STAT3-shRNA 轉(zhuǎn)入前列腺癌細胞系，MTT法檢測對細胞生長的抑制作用，丫啶橙染色觀察細胞凋亡。制作前列腺癌小鼠模型，將G5-PAMAM-D與質(zhì)粒 pSilencing4.1-STAT3-shRNA的混合物注射入荷瘤鼠腫瘤內(nèi)，觀察對腫瘤生長的抑制作用。 結(jié)果：體外實驗表明 G5-PAMAM-D可將pSilencing4.1- EGFP-shRNA轉(zhuǎn)入前列腺癌細胞，并明顯沉默EGFP的表

9、達，同樣可將pSilencing4.1-STAT3-shRNA有效轉(zhuǎn)入前列腺癌細胞中，明顯抑制腫瘤細胞的生長，增加細胞的凋亡。體內(nèi)實驗證明G5-PAMAM-D/pSilencing4.1-STAT3-shRNA 可抑制荷瘤鼠前列腺癌的生長，而各對照組腫瘤生長無明顯抑制。 結(jié)論：G5-PAMAM-D作為基因載體，可將shRNA的真核表達質(zhì)粒在體內(nèi)外轉(zhuǎn)入前列腺癌組織細胞，并有效表達shRNA，G5-PAMAM-D可能成為應(yīng)用前景廣闊

10、的小干擾RNA(siRNA)的載體。 第三部分轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的G5-PAMAM-D介導shRNA特異性沉默列腺癌基因表達的研究 目的：本部分研究將轉(zhuǎn)鐵蛋白與G5-PAMAM-D連接，得到腫瘤選擇性載體G5-PAMAM-D-Tf，并應(yīng)用其作為shRNA 真核表達質(zhì)粒的載體，在體外進行轉(zhuǎn)染干擾實驗，考察G5-PAMAM-D-Tf靶向性的載體進行前列腺癌RNA干擾基因治療的可行性。 方法：先用二硫鍵法以轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tran

11、sferrin，Tf)修飾的G5-PAMAM-D，得到靶向性載體G5-PAMAM-D-T-Tf。以G5-PAMAM-D-Tf為載體將pSilencing4.1-EGFP-shRNA 和 pSilencing4.1-STAT3-shRNA 在體外轉(zhuǎn)染不同細胞，用熒光觀察、RT-PCR、Western blotting及MTT法觀察對不同細胞中外源性基因EGFP和內(nèi)源性性基因STAT3的抑制作用，考察G5-PAMAM-D-Tf靶向性和有效性

12、。 結(jié)果：G5-PAMAM-D-Tf可特異性地將pSilencing4.1- EGFP-shRNA和pSilencing4.1-STAT3-shRNA轉(zhuǎn)入前列腺癌細胞，沉默其EGFP和STAT3的表達，而在正常組織細胞EGFP和STAT3的表達抑制不明顯。STAT3沉默導致的生長抑制也特異性地發(fā)生在前列腺癌細胞。 結(jié)論：G5-PAMAM-D-Tf作為一種靶向性的基因載體，可以將shRNA的真核表達質(zhì)粒靶向性地轉(zhuǎn)入前列腺癌