具有肝實質(zhì)細胞線粒體靶向功能的納米遞釋系統(tǒng)的研究.pdf

1、惡性腫瘤的防治始終是生命科學研究領域的一個難點。本論文根據(jù)腫瘤局部和線粒體的生理特點要求，設計了兩種新型的多功能高分子材料N-甘草次酸-酸敏感橋-聚乙二醇-殼聚糖衍生物(N-glycyrrhetinic acid(GA)-polyethylene glycol(PEG)-chitosanderivatives, NGPC)和N-季銨-殼聚糖衍生物(N-quaternary ammonium-chitosanderivatives, NQ

2、C)，并以此為構(gòu)筑單元，以馬錢子堿（Brucine）為模型藥物，構(gòu)建新型多功能納米藥物遞釋系統(tǒng)（MNPs）。在該系統(tǒng)中，聚乙二醇具有較長的親水鏈，可以在納米粒周圍形成水化層，減少血液中巨噬細胞的吞噬，延長遞釋系統(tǒng)在體內(nèi)循環(huán)時間，同時對季銨正離子起屏蔽作用，減少其在生理環(huán)境中的毒性。水化層表面的甘草次酸具有肝實質(zhì)細胞主動靶向的功能，當載體系統(tǒng)被內(nèi)吞進入到肝細胞的內(nèi)涵體/溶酶體后，由于微環(huán)境 pH值的降低，納米粒表面的水化層隨著 GA-PE

3、G脫落而消失，裸露出帶季銨正離子的正電荷殼聚糖納米粒，同時亞胺基團產(chǎn)生強烈的質(zhì)子海綿效應，逃逸出溶酶體，通過正負電荷的吸引濃集于線粒體表面，釋放出藥物，抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。
　　在課題組前期研究的基礎上，本課題首先用離子交聯(lián)法制備了載馬錢子堿的殼聚糖多功能釋系統(tǒng)(Brucine/MNPs)，以及分別由NGPC和NQC為構(gòu)筑材料制備的參比制劑(Brucine/NGPC-NPs和Brucine/NQC-NPs),對其外

4、觀形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位、包封率、載藥量、水化層厚度、體外釋放及質(zhì)子海綿效應等理化性質(zhì)進行了詳細考察。結(jié)果顯示，Brucine/MNPs的包封率為68.53±2.42％，載藥量為6.01±0.27%，粒徑為185.3±6.9nm，并且Brucine/MNPs保持著與空白MNPs相當?shù)?pH響應的電荷翻轉(zhuǎn)能力和內(nèi)體逃逸能力，透射電鏡照片下觀察Brucine/MNPs為球形，分散較好，與納米粒徑儀測定粒徑基本相當。體外釋放表明，Bru

5、cine/MNPs在pH7.4和pH4.5下的釋放行為基本一致，都具有緩釋作用。
　　以溶液劑和Brucine/NQC-NPs作為參比制劑，對Brucine/NGPC-NPs和Brucine/MNPs在小鼠體內(nèi)的組織分布行為進行了考察，以相對攝取率(Relative ratio, Re)和峰濃度比(Concentration ratio, Ce)等為評價指標，評價其對肝組織的靶向性。研究結(jié)果顯示，Brucine/NGPC-NPs和

6、Brucine/MNPs具有較強的肝靶向性，以AUC0-t計算，二者的Re值分別是Brucine/NQC-NPs的4.89倍和5.02倍，Ce值分別是Brucine/NQC-NPs的2.49倍和2.57倍，其肝靶向效率和相對靶向效率也都顯著提高，具有較強的肝組織選擇性。
　　以人肝癌 HepG2細胞為細胞模型，考察濃度、時間、溫度對其細胞攝取的影響，并對其細胞攝取機制進行初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞對各制劑的攝取均具有時間和

7、濃度依賴性，且對Brucine/NGPC-NPs和Brucine/MNPs的攝取明顯強于Brucine/NQC-NPs和Brucine solution。為了進一步研究其被細胞內(nèi)化的機制，考察甘草次酸和各種內(nèi)吞抑制劑對細胞攝取的影響，發(fā)現(xiàn) HepG2細胞對Brucine/MNPs的攝取過程需要轉(zhuǎn)運蛋白的參與，且主要通過表面的甘草次酸配體與肝細胞表面的甘草次酸受體結(jié)合的方式來增加在靶細胞的濃集，之后通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞路徑被細胞內(nèi)化進入

8、細胞內(nèi)涵體/溶酶體。采用激光共聚焦顯微鏡定性觀察Brucine/NGPC-NPs、Brucine/NQC-NPs和Brucine/MNPs在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程，并結(jié)合HPLC檢測HepG2細胞線粒體內(nèi)Brucine的累積量，定量考察Brucine/MNPs的線粒體靶向作用。研究表明，與NGPC-NPs和NQC-NPs相比，MNPs具有顯著的內(nèi)涵體/溶酶體逃逸能力和線粒體靶向作用。
　　考察了四種Brucine制劑的體外抗腫瘤活性，并

9、對其促腫瘤細胞凋亡機制進行了初步探討，結(jié)果表明，在各給藥濃度下，載藥納米制劑均表現(xiàn)出了較強的殺死腫瘤細胞的能力，且Brucine/MNPs明顯強于其它制劑，細胞總凋亡率增加，結(jié)合透射電鏡觀察和流式細胞儀發(fā)現(xiàn)，線粒體出現(xiàn)了明顯的腫脹和變形，并伴隨著線粒體膜電位的降低和細胞色素 C的釋放，且載體的引入并沒有改變細胞周期的變化，細胞周期仍被阻滯在G2期。上述結(jié)果表明，多功能納米載藥系統(tǒng)不僅能夠促進腫瘤細胞的攝取，還能有效地實現(xiàn)藥物的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運

10、，促進腫瘤細胞的凋亡，增強藥物對腫瘤細胞的殺傷力。
　　建立Heps異位荷瘤小鼠模型，考察MNPs的體內(nèi)抗腫瘤藥效學，結(jié)果顯示，Brucine/MNPs在有效抑制腫瘤生長的同時，可以顯著延長荷瘤小鼠的生存時間，腫瘤組織病理切片顯示，經(jīng)Brucine/MNPs治療后，腫瘤壞死面積最大，凋亡細胞占細胞總數(shù)的比例增加，Cleaved caspase-3活化檢測結(jié)果表明相較于其它組，Brucine/MNPs組有大量的Cleaved cas

11、pase-3蛋白表達，進而活化一系列與細胞凋亡相關的酶，導致更多的腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮更強的抗腫瘤效應。
　　本論文構(gòu)建的智能型線粒體靶向納米載藥系統(tǒng)，針對肝組織細胞的表面特性和腫瘤細胞微環(huán)境pH的變化，發(fā)生了在體的高度響應，增加了藥物在肝組織的蓄積和肝腫瘤細胞的攝取，實現(xiàn)了藥物在細胞內(nèi)的有效傳遞和線粒體的定位釋放，抑制了腫瘤細胞的生長，提高了抗腫瘤效果，降低了有毒性中藥抗腫瘤有效成分的毒副作用，為線粒體靶點藥物提供了安全、高效的載