RKIP在肝星狀細(xì)胞粘附過程中的作用.pdf

1、肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化乃至肝功能衰竭的病理基礎(chǔ)，因而，阻止肝纖維化發(fā)生這一過程已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究慢性肝病的中心議題。在這一過程中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的生成和降解失衡，其量和質(zhì)發(fā)生變化，從以Ⅳ型膠原組成為主，變?yōu)橐岳w維膠原組成為主(如Ⅰ型、Ⅲ型膠原)。由此肝臟的質(zhì)地、韌度及血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，使肝功能出現(xiàn)異常，并且可能引起多種并發(fā)癥。
　　肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate

2、 cells，HSCs)在肝纖維化過程中被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，生成細(xì)胞外基質(zhì)及一系列生長(zhǎng)因子、促炎因子，這奠定了HSCs在肝纖維化過程中的中心地位。因此，干預(yù)HSCs、影響其生物學(xué)行為是阻斷、減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究切入點(diǎn)。
　　Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)是1999年被Yeung K等利用酵母雙雜交篩選法分離出的一種Raf激酶抑制蛋白，它可以與Raf-1結(jié)合抑制

3、其磷酸化MEK，從而抑制Raf-1/MEK/ERK1，2信號(hào)通路的激活，進(jìn)而可以影響HSCs的增殖分化等生物學(xué)行為。近年來RKIP在癌癥中的功能和作用研究較多，同時(shí)國(guó)內(nèi)有研究證實(shí)RKIP可以抑制HSCs細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HSCs的細(xì)胞遷移。本研究我們將揭示RKIP在HSCs粘附過程中的作用。
　　目的：本文主要通過RKIP過表達(dá)及RNAi技術(shù)，模擬不同生理病理狀態(tài)下ECM成分的改變，探討RKIP對(duì)HSCs粘附功能的影響。
　　

4、方法：實(shí)驗(yàn)LX-2細(xì)胞共分四組，分別是RKIP過表達(dá)組(RKIP-Ad)及陰性對(duì)照組(GFP-Ad)；應(yīng)用用RNAi技術(shù)的RKIP抑制組(RKIP-RNAi-Ad)及陰性對(duì)照組(NC-GFP-Ad)。首先確定細(xì)胞感染病毒的最適MOI(multiplicity of infection)值：體外培養(yǎng)傳代LX-2細(xì)胞株，72 h傳代一次。當(dāng)細(xì)胞融合至80％左右時(shí)開始給予感染病毒，MOI值設(shè)四個(gè)水平，分別是5、10、15、20。于12 h、2

5、4 h、48 h時(shí)在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，計(jì)數(shù)細(xì)胞熒光數(shù)，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行感染率的驗(yàn)證，篩選出最適MOI值及感染時(shí)間。其次確定感染病毒后是否確有RKIP的過表達(dá)和抑制：以最適MOI值及感染時(shí)間感染細(xì)胞，Western Blot方法驗(yàn)證各組RKIP表達(dá)情況。應(yīng)用透射電鏡觀察細(xì)胞間連接。已干預(yù)好的細(xì)胞稀釋成1.0×105/ml的濃度種在蓋玻片和已準(zhǔn)備好的由Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、matrigel及fibronectin包被的24孔板中

6、，每種干預(yù)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，1 h后200×下取12個(gè)視野計(jì)數(shù)粘附的細(xì)胞數(shù)，資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.人HSCs LX-2細(xì)胞株的腺病毒感染率可達(dá)到80％～90％。適宜的MOI值為5，感染時(shí)間為48 h。感染時(shí)間過短，熒光表達(dá)率低；MOI值過大則細(xì)胞毒性過大，細(xì)胞狀態(tài)變差，甚至碎裂。
　　2.RKIP過表達(dá)組較對(duì)照組蛋白表達(dá)增多(3.47±0.02 vs1.74±0.13，P<

7、0.05，n=3)。RKIP抑制組較對(duì)照組蛋白表達(dá)明顯減少(0.29±0.06 vs0.73±0.14，P<0.05，n=3)。
　　3.RKIP過表達(dá)促進(jìn)HSCs在glass上的粘附，過表達(dá)組和抑制組的粘附細(xì)胞數(shù)分別為(158±68 vs81±12，P<0.05，n=12)。RKIP的低表達(dá)，抑制其在glass上的粘附(83±10 vs131±43，P<0.05，n=12)；RKIP在HSCs與基質(zhì)的粘附上的作用與在glass上

8、的作用相反。RKIP的過表達(dá)抑制HSCs與matrigel、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白的粘附。Matrigel上RKIP過表達(dá)組與對(duì)照組分別為(80±14 vs152±42，P<0.05，n=12)；Ⅰ型膠原上為(70±13 vs138±36，P<0.05，n=12)；Ⅳ型膠原(92±6 vs124±32，P<0.05，n=12)；纖維連接蛋白(133±27 vs276±106，P<0.05，n=12)；而RKIP的抑制組促進(jìn)HS

9、Cs與以上基質(zhì)的粘附，Matrigel基質(zhì)膠表面的粘附為(170±25 vs66±12，P<0.05，n=12)；Ⅰ型膠原表面粘附為(200±25 vs82±13，P<0.05，n=12)；Ⅳ型膠原為(167±22 vs96±14，P<0.05，n=12)；纖維連接蛋白為(276±28 vs96±17，P<0.05，n=12)。
　　結(jié)論：RKIP在肝星狀細(xì)胞粘附的過程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用：RKIP促進(jìn)HSCs在glass上的粘附