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文檔簡(jiǎn)介
1、肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化乃至肝功能衰竭的病理基礎(chǔ),因而,阻止肝纖維化發(fā)生這一過(guò)程已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究慢性肝病的中心議題。在這一過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的生成和降解失衡,其量和質(zhì)發(fā)生變化,從以Ⅳ型膠原組成為主,變?yōu)橐岳w維膠原組成為主(如Ⅰ型、Ⅲ型膠原)。由此肝臟的質(zhì)地、韌度及血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變,使肝功能出現(xiàn)異常,并且可能引起多種并發(fā)癥。
肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate
2、 cells,HSCs)在肝纖維化過(guò)程中被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,生成細(xì)胞外基質(zhì)及一系列生長(zhǎng)因子、促炎因子,這奠定了HSCs在肝纖維化過(guò)程中的中心地位。因此,干預(yù)HSCs、影響其生物學(xué)行為是阻斷、減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究切入點(diǎn)。
Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)是1999年被Yeung K等利用酵母雙雜交篩選法分離出的一種Raf激酶抑制蛋白,它可以與Raf-1結(jié)合抑制
3、其磷酸化MEK,從而抑制Raf-1/MEK/ERK1,2信號(hào)通路的激活,進(jìn)而可以影響HSCs的增殖分化等生物學(xué)行為。近年來(lái)RKIP在癌癥中的功能和作用研究較多,同時(shí)國(guó)內(nèi)有研究證實(shí)RKIP可以抑制HSCs細(xì)胞的增殖,促進(jìn)HSCs的細(xì)胞遷移。本研究我們將揭示RKIP在HSCs粘附過(guò)程中的作用。
目的:本文主要通過(guò)RKIP過(guò)表達(dá)及RNAi技術(shù),模擬不同生理病理狀態(tài)下ECM成分的改變,探討RKIP對(duì)HSCs粘附功能的影響。
4、方法:實(shí)驗(yàn)LX-2細(xì)胞共分四組,分別是RKIP過(guò)表達(dá)組(RKIP-Ad)及陰性對(duì)照組(GFP-Ad);應(yīng)用用RNAi技術(shù)的RKIP抑制組(RKIP-RNAi-Ad)及陰性對(duì)照組(NC-GFP-Ad)。首先確定細(xì)胞感染病毒的最適MOI(multiplicity of infection)值:體外培養(yǎng)傳代LX-2細(xì)胞株,72 h傳代一次。當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時(shí)開(kāi)始給予感染病毒,MOI值設(shè)四個(gè)水平,分別是5、10、15、20。于12 h、2
5、4 h、48 h時(shí)在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),計(jì)數(shù)細(xì)胞熒光數(shù),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行感染率的驗(yàn)證,篩選出最適MOI值及感染時(shí)間。其次確定感染病毒后是否確有RKIP的過(guò)表達(dá)和抑制:以最適MOI值及感染時(shí)間感染細(xì)胞,Western Blot方法驗(yàn)證各組RKIP表達(dá)情況。應(yīng)用透射電鏡觀察細(xì)胞間連接。已干預(yù)好的細(xì)胞稀釋成1.0×105/ml的濃度種在蓋玻片和已準(zhǔn)備好的由Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、matrigel及fibronectin包被的24孔板中
6、,每種干預(yù)設(shè)3個(gè)復(fù)孔,1 h后200×下取12個(gè)視野計(jì)數(shù)粘附的細(xì)胞數(shù),資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果:
1.人HSCs LX-2細(xì)胞株的腺病毒感染率可達(dá)到80%~90%。適宜的MOI值為5,感染時(shí)間為48 h。感染時(shí)間過(guò)短,熒光表達(dá)率低;MOI值過(guò)大則細(xì)胞毒性過(guò)大,細(xì)胞狀態(tài)變差,甚至碎裂。
2.RKIP過(guò)表達(dá)組較對(duì)照組蛋白表達(dá)增多(3.47±0.02 vs1.74±0.13,P<
7、0.05,n=3)。RKIP抑制組較對(duì)照組蛋白表達(dá)明顯減少(0.29±0.06 vs0.73±0.14,P<0.05,n=3)。
3.RKIP過(guò)表達(dá)促進(jìn)HSCs在glass上的粘附,過(guò)表達(dá)組和抑制組的粘附細(xì)胞數(shù)分別為(158±68 vs81±12,P<0.05,n=12)。RKIP的低表達(dá),抑制其在glass上的粘附(83±10 vs131±43,P<0.05,n=12);RKIP在HSCs與基質(zhì)的粘附上的作用與在glass上
8、的作用相反。RKIP的過(guò)表達(dá)抑制HSCs與matrigel、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白的粘附。Matrigel上RKIP過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組分別為(80±14 vs152±42,P<0.05,n=12);Ⅰ型膠原上為(70±13 vs138±36,P<0.05,n=12);Ⅳ型膠原(92±6 vs124±32,P<0.05,n=12);纖維連接蛋白(133±27 vs276±106,P<0.05,n=12);而RKIP的抑制組促進(jìn)HS
9、Cs與以上基質(zhì)的粘附,Matrigel基質(zhì)膠表面的粘附為(170±25 vs66±12,P<0.05,n=12);Ⅰ型膠原表面粘附為(200±25 vs82±13,P<0.05,n=12);Ⅳ型膠原為(167±22 vs96±14,P<0.05,n=12);纖維連接蛋白為(276±28 vs96±17,P<0.05,n=12)。
結(jié)論:RKIP在肝星狀細(xì)胞粘附的過(guò)程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用:RKIP促進(jìn)HSCs在glass上的粘附
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