熊果酸對原代肝星狀細胞活化過程中NOX-Hedgehog信號網(wǎng)絡的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  肝纖維化是由多種病因所引起的慢性肝臟疾病的共同病理過程,其主要特征為細胞外基質(extracellular matrix,ECM)增生與降解失衡,導致肝臟內ECM過度沉積?;罨母涡菭罴毎╤epatic stellate cells,HSCs)是ECM產(chǎn)生的主要細胞來源,因此,原代肝星狀細胞(Quiescent hepatic stellate cells,Q-HSCs)的激活、增殖并轉化為成纖維細胞樣肝星狀細胞(m

2、yofibroblastic hepatic stellate cells,MF-HSCs)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵性作用。Hedgehog(Hh)信號通路在肝臟胚胎發(fā)育以及成熟肝臟的損傷修復過程發(fā)揮著重要的作用。越來越多研究表明,Hh信號通路的持續(xù)激活促進Q-HSC轉化為MF-HSC,進而促進肝纖維化發(fā)展。NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)參與介導一系列促纖維化信號通路,有學者研究發(fā)現(xiàn),NOX亞基Rac1參

3、與了對Hh信號通路的調控,它能激活Hh通路,進而促使Q-HSC激活轉化為MF-HSC。我們前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能顯著抑制瘦素誘導的HSC-T6中NOX亞基Rac1蛋白表達,進而抑制Hh信號通路活性?;谝陨涎芯考扒捌谘芯砍晒?,本研究將進一步以原代HSC為研究對象,觀察Q-HSC轉化過程中NOX對Hh信號通路的調控作用及熊果酸對該信號網(wǎng)絡的的影響。
  目的:
  觀察Q-HSC活化轉化過程中NOX對Hh信號通路的調控作用,明確

4、熊果酸對NOX-Hh信號網(wǎng)絡的影響及機制。
  方法:
  取分離提取長至第5天的原代肝星狀細胞,隨機分成以下各組:正常對照組;熊果酸組(40μM);TGF-β組(5μg/L);熊果酸干預組(TGF-β+熊果酸);DPI干預組(TGF-β+DPI10μM)。干預組分別給予熊果酸和DPI(NOX特異性抑制劑)預處理半小時之后再加入TGF-β,各組經(jīng)相應藥物作用12h后,提取細胞總RNA,用qRT-PCR法檢測藥物處理后HSC對

5、I型膠原和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)mRNA表達以及Hh信號通路中Shh、Smo、Gli2和NOX亞基Rac1的mRNA表達;藥物作用24小時后,提取每組HSC總蛋白,采用Western blotting分別檢測Rac1、Shh、Smo、Gli2及α-SMA蛋白表達。
  結果:
  1.熊果酸對Q-HSC活化過程中I型膠原mRNA、α-SMA mRNA表達的影響
  TGF-β刺激原代HSC12h后,I型膠原和

6、α-SMA mRNA的表達比空白對照組明顯增加(P<0.01);熊果酸自身對照組I型膠原和α-SMA mRNA表達明顯低于空白對照組(P<0.05;P<0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進行干預后其I型膠原和α-SMA mRNA水平較TGF-β刺激組顯著降低(P<0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比I型膠原和α-SMA mRNA的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。以上結果說明,原代HSC在活化過程中I型膠原和α-

7、SMA mRNA表達明顯升高,而熊果酸干預能抑制原代HSC活化過程中I型膠原和α-SMA mRNA表達。
  2.熊果酸對Q-HSC活化過程中Rac1 mRNA表達的影響
  TGF-β刺激原代HSC12h后,Rac1 mRNA的表達比空白對照組明顯增加(P<0.01);熊果酸自身對照組Rac1 mRNA表達明顯低于空白對照組(P<0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進行干預后其Rac1 mRNA水平較TGF

8、-β刺激組顯著降低(P<0.05),并且與NOX的抑制劑DPI相比Rac1 mRNA的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。以上結果說明,原代HSC在活化過程中NOX亞基Rac1表達上調,熊果酸可抑制原代HSC活化過程中NOX亞基Rac1 mRNA的表達。
  3.熊果酸對Q-HSC活化過程中Shh、Smo、Gli2 mRNA表達的影響
  TGF-β刺激原代HSC12h后,Shh、Smo、Gli2 mRNA的表達比空白對照組明

9、顯增加(P<0.01;P<0.01;P<0.05);熊果酸自身對照組Shh、Smo、Gli2 mRNA表達明顯低于空白對照組(P<0.01;P<0.01;P<0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進行干預后其Shh、Smo、Gli2 mRNA水平較TGF-β刺激組顯著降低(P<0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比Shh、Smo、Gli2 mRNA的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。以上結果說明,原代HSC在活化過程中

10、Hh信號通路的Shh、Smo、Gli2基因表達上調,NOX參與了Shh、Smo、Gli2基因表達的調控,熊果酸可抑制原代HSC活化過程中Shh、Smo、Gli2 mRNA的表達。
  4.熊果酸對Q-HSC活化過程中α-SMA蛋白表達的影響
  TGF-β刺激原代HSC24h后,α-SMA蛋白表達比空白對照組明顯增加(P<0.01);熊果酸自身對照組α-SMA蛋白表達明顯低于空白對照組(P<0.05);在TGF-β刺激原代H

11、SC之前加入熊果酸進行干預后其α-SMA蛋白水平較TGF-β刺激組顯著降低(P<0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比α-SMA蛋白表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。由于α-SMA蛋白是HSC活化的標志,以上結果說明NOX介導了TGF-β誘導的原代HSC活化,熊果酸可抑制原代HSC活化。
  5.熊果酸對Q-HSC活化過程中Rac1蛋白表達的影響
  TGF-β刺激原代HSC24h后,Rac1蛋白表達比空白對照組明顯增加

12、(P<0.05);熊果酸自身對照組Rac1蛋白表達明顯低于空白對照組(P<0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進行干預后其Rac1蛋白水平較TGF-β刺激組顯著降低(P<0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比Rac1蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。以上結果說明,原代HSC活化過程中NOX亞基Rac1表達上調,熊果酸可抑制原代HSC活化過程中NOX亞基Rac1蛋白的表達。
  6.熊果酸對Q-HSC活化過

13、程中Shh、Smo、Gli2蛋白表達的影響
  TGF-β刺激原代HSC24h后,Shh、Smo、Gli2蛋白的表達比空白對照組明顯增加(P<0.05;P<0.05;P<0.01);熊果酸自身對照組Shh、Smo、Gli2蛋白表達明顯低于空白對照組(P<0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進行干預后其Shh、Smo、Gli2蛋白表達水平較TGF-β刺激組顯著降低(P<0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比Shh

14、、Smo、Gli2蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。以上結果說明,原代HSC在活化過程中Hh信號通路的Shh、Smo、Gli2蛋白表達上調,NOX參與了Shh、Smo、Gli2蛋白表達的調控,熊果酸可抑制原代HSC活化過程中Shh、Smo、Gli2蛋白的表達。
  結論:
  1、TGF-β誘導Q-HSC激活轉化為MF-HSC過程中NOX參與調控Hh信號通路Shh、Smo、Gli2的基因和蛋白表達。
  2、熊果

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