熊果酸對(duì)原代肝星狀細(xì)胞活化過程中NOX-Hedgehog信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響.pdf

1、背景：
　　肝纖維化是由多種病因所引起的慢性肝臟疾病的共同病理過程，其主要特征為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）增生與降解失衡，導(dǎo)致肝臟內(nèi)ECM過度沉積?；罨母涡菭罴?xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）是ECM產(chǎn)生的主要細(xì)胞來源，因此，原代肝星狀細(xì)胞（Quiescent hepatic stellate cells,Q-HSCs）的激活、增殖并轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣肝星狀細(xì)胞（m

2、yofibroblastic hepatic stellate cells,MF-HSCs）在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用。Hedgehog（Hh）信號(hào)通路在肝臟胚胎發(fā)育以及成熟肝臟的損傷修復(fù)過程發(fā)揮著重要的作用。越來越多研究表明，Hh信號(hào)通路的持續(xù)激活促進(jìn)Q-HSC轉(zhuǎn)化為MF-HSC，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）參與介導(dǎo)一系列促纖維化信號(hào)通路，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，NOX亞基Rac1參

3、與了對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控，它能激活Hh通路，進(jìn)而促使Q-HSC激活轉(zhuǎn)化為MF-HSC。我們前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6中NOX亞基Rac1蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制Hh信號(hào)通路活性?；谝陨涎芯考扒捌谘芯砍晒?，本研究將進(jìn)一步以原代HSC為研究對(duì)象，觀察Q-HSC轉(zhuǎn)化過程中NOX對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控作用及熊果酸對(duì)該信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的的影響。
　　目的：
　　觀察Q-HSC活化轉(zhuǎn)化過程中NOX對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控作用，明確

4、熊果酸對(duì)NOX-Hh信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　取分離提取長(zhǎng)至第5天的原代肝星狀細(xì)胞，隨機(jī)分成以下各組：正常對(duì)照組；熊果酸組（40μM）；TGF-β組（5μg/L）；熊果酸干預(yù)組（TGF-β+熊果酸）；DPI干預(yù)組（TGF-β+DPI10μM）。干預(yù)組分別給予熊果酸和DPI（NOX特異性抑制劑）預(yù)處理半小時(shí)之后再加入TGF-β，各組經(jīng)相應(yīng)藥物作用12h后，提取細(xì)胞總RNA，用qRT-PCR法檢測(cè)藥物處理后HSC對(duì)

5、I型膠原和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）mRNA表達(dá)以及Hh信號(hào)通路中Shh、Smo、Gli2和NOX亞基Rac1的mRNA表達(dá)；藥物作用24小時(shí)后，提取每組HSC總蛋白，采用Western blotting分別檢測(cè)Rac1、Shh、Smo、Gli2及α-SMA蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過程中I型膠原mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSC12h后，I型膠原和

6、α-SMA mRNA的表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加（P<0.01）；熊果酸自身對(duì)照組I型膠原和α-SMA mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05；P<0.01）；在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其I型膠原和α-SMA mRNA水平較TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），并且與NOX的抑制劑DPI相比I型膠原和α-SMA mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明，原代HSC在活化過程中I型膠原和α-

7、SMA mRNA表達(dá)明顯升高，而熊果酸干預(yù)能抑制原代HSC活化過程中I型膠原和α-SMA mRNA表達(dá)。
　　2.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過程中Rac1 mRNA表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSC12h后，Rac1 mRNA的表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加（P<0.01）；熊果酸自身對(duì)照組Rac1 mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Rac1 mRNA水平較TGF

8、-β刺激組顯著降低（P<0.05），并且與NOX的抑制劑DPI相比Rac1 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明，原代HSC在活化過程中NOX亞基Rac1表達(dá)上調(diào)，熊果酸可抑制原代HSC活化過程中NOX亞基Rac1 mRNA的表達(dá)。
　　3.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過程中Shh、Smo、Gli2 mRNA表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSC12h后，Shh、Smo、Gli2 mRNA的表達(dá)比空白對(duì)照組明

9、顯增加（P<0.01；P<0.01；P<0.05）；熊果酸自身對(duì)照組Shh、Smo、Gli2 mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01；P<0.01；P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Shh、Smo、Gli2 mRNA水平較TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），并且與NOX的抑制劑DPI相比Shh、Smo、Gli2 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明，原代HSC在活化過程中

10、Hh信號(hào)通路的Shh、Smo、Gli2基因表達(dá)上調(diào)，NOX參與了Shh、Smo、Gli2基因表達(dá)的調(diào)控，熊果酸可抑制原代HSC活化過程中Shh、Smo、Gli2 mRNA的表達(dá)。
　　4.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過程中α-SMA蛋白表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSC24h后，α-SMA蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加（P<0.01）；熊果酸自身對(duì)照組α-SMA蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；在TGF-β刺激原代H

11、SC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其α-SMA蛋白水平較TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），并且與NOX的抑制劑DPI相比α-SMA蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。由于α-SMA蛋白是HSC活化的標(biāo)志，以上結(jié)果說明NOX介導(dǎo)了TGF-β誘導(dǎo)的原代HSC活化，熊果酸可抑制原代HSC活化。
　　5.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過程中Rac1蛋白表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSC24h后，Rac1蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加

12、（P<0.05）；熊果酸自身對(duì)照組Rac1蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01）；在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Rac1蛋白水平較TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），并且與NOX的抑制劑DPI相比Rac1蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明，原代HSC活化過程中NOX亞基Rac1表達(dá)上調(diào)，熊果酸可抑制原代HSC活化過程中NOX亞基Rac1蛋白的表達(dá)。
　　6.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過

13、程中Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSC24h后，Shh、Smo、Gli2蛋白的表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加（P<0.05；P<0.05；P<0.01）；熊果酸自身對(duì)照組Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01）；在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)水平較TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），并且與NOX的抑制劑DPI相比Shh

14、、Smo、Gli2蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明，原代HSC在活化過程中Hh信號(hào)通路的Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)上調(diào)，NOX參與了Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)的調(diào)控，熊果酸可抑制原代HSC活化過程中Shh、Smo、Gli2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、TGF-β誘導(dǎo)Q-HSC激活轉(zhuǎn)化為MF-HSC過程中NOX參與調(diào)控Hh信號(hào)通路Shh、Smo、Gli2的基因和蛋白表達(dá)。
　　2、熊果