Wnt經(jīng)典信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞中的作用及肝復(fù)康的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 肝纖維化的形成是機(jī)體對(duì)肝損傷的一種修復(fù)過(guò)程，其特征性改變是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)在肝臟中過(guò)度沉積。肝纖維化的形成基礎(chǔ)是肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)的活化，活化的HSC細(xì)胞合成大量的ECM、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)等。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路與肝纖維化的發(fā)生有著密切聯(lián)系，尤其是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路，

2、也稱為Wnt/β-catenin信號(hào)通路。β-catenin(β-連環(huán)蛋白)是一種多功能的胞漿蛋白，也能介導(dǎo)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的關(guān)鍵因子。糖原合成酶激酶(GSK-3β)在Wnt經(jīng)典信號(hào)通路中可使β-catenin磷酸化并參與其隨后的降解過(guò)程，從而保持經(jīng)典Wnt通路的靜止?fàn)顟B(tài)。而SB216763是GSK-3β的抑制劑，使胞漿中β-catenin大量累積并入核，從而激活Wnt經(jīng)典信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GSK-3β抑制劑抑制其

3、在體外培養(yǎng)的大鼠HSC細(xì)胞中的活性，通過(guò)測(cè)定β-catenin的水平以及Wnt靶基因mRNA的表達(dá)預(yù)探討經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在大鼠HSC細(xì)胞中的作用機(jī)制。
　　 近年來(lái)中藥復(fù)方制劑治療肝纖維化的研究取得了很大進(jìn)展，肝復(fù)康是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年實(shí)驗(yàn)總結(jié)的中藥復(fù)方制劑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞并使用SB216763及中藥肝復(fù)康藥物血清干預(yù)，預(yù)探討肝復(fù)康通過(guò)Wnt經(jīng)典信號(hào)通路抗肝纖維化的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培

4、養(yǎng):
　　 大鼠HSC-T6細(xì)胞株用含10％胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到良好狀態(tài)后，所有細(xì)胞用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24小時(shí)后分組加藥。細(xì)胞隨機(jī)分五組加藥，SB216763工作濃度依次為5，10，20，30，40umol/L(uM)，培養(yǎng)12小時(shí)后用比色微量滴定唑法(Microtitretetrazolium，MTT)檢測(cè)加藥后細(xì)胞增殖情況，分析數(shù)據(jù)并選定SB216763最佳工

5、作濃度為10uM、20uM。
　　 將細(xì)胞隨機(jī)分為以下五組:對(duì)照組(DMEM中加10％正常血清);SB21676310uM組;SB21676320uM組;肝復(fù)康組（10％肝復(fù)康藥物血清）;SB21676320uM加肝復(fù)康組(SB21676320uM基礎(chǔ)上用10％肝復(fù)康藥物血清干預(yù))。
　　 2.MTT:檢測(cè)加藥后大鼠HSC細(xì)胞增殖情況。
　　 3.QuantReverseTranscriptase(RT)-pol

6、ymerasechainreaction(PCR):
　　 檢測(cè)大鼠HSC細(xì)胞中GSK-3β，β-catenin，CollagenⅠ、Ⅲ，α-SMA，Wnt1，Wnt3a，Wnt10bmRNA的表達(dá)。
　　 4.免疫蛋白印跡(Western-blot):
　　 檢測(cè)大鼠HSC細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)。
　　 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　 結(jié)果:
　　 1

7、.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 SB21676310uM組與SB21676320uM組肝星狀細(xì)胞均較對(duì)照組增殖明顯，肝復(fù)康藥物血清組較對(duì)照組增殖明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);同時(shí)，肝復(fù)康藥物血清加SB21676320uM組細(xì)胞增殖程度于SB216763組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.RT-RCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 SB21676310uM與SB21676320uM組肝星狀細(xì)胞明

8、顯活化，CollagenⅠ、a-SMA、β-catenin、Wnt1、Wnt3a、Frizzled1、Frizzled2mRNA表達(dá)量明顯增加，而肝復(fù)康藥物血清組HSC細(xì)胞的表達(dá)量則明顯下降，較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)SB216763(20uM)加肝復(fù)康藥物血清組與SB21676320uM組比較也能較好的抑制以上各指標(biāo)的表達(dá)。SB21676320uM組Gsk-3βmRNA表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

9、0.05)。
　　 3.Western-blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 對(duì)照組大鼠肝星狀細(xì)胞中β-catenin低表達(dá)，SB21676310uM組和20uM組相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞β-catenin表達(dá)量明顯增加，而肝復(fù)康藥物血清組相對(duì)于對(duì)照組其表達(dá)量則明顯下降(P＜0.05);SB21676320(uM)加肝復(fù)康藥物血清組相對(duì)于SB21676320uM組β-catenin表達(dá)量同樣下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。