APN抑制劑LJNK與基于APN的協(xié)同前藥Bc-A1的抗腫瘤活性研究.pdf

1、惡性腫瘤的致病因素多，發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，這就造成了其治療的復(fù)雜性。目前惡性腫瘤的主要治療手段包括手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療。傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物都存在一定的毒副作用，長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐藥性，限制了腫瘤的治療效果。
　　氨肽酶N是M1家族的金屬蛋白酶，可以從蛋白質(zhì)和多肽的氨基端降解中性氨基酸，從而參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答、神經(jīng)肽和細(xì)胞因子的降解、抗原呈遞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及血管生成等。APN在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，與腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移

2、及腫瘤新生血管形成密切相關(guān)，抑制APN的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　本課題組通過(guò)前期的計(jì)算機(jī)虛擬篩選和初步活性測(cè)定，獲得了吲哚-2，3-酮類化合物L(fēng)JNK，該化合物不僅對(duì)豬腎微粒體APN表現(xiàn)出了良好的抑制作用和一定的選擇性，而且在體外對(duì)人腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗增殖作用。在本課題的第一部分中，我們從多個(gè)方面對(duì)LJNK的體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　化療藥物吉西他濱在腫瘤的化學(xué)治療中起著重要作

3、用。然而，體內(nèi)迅速代謝失活限制了吉西他濱的臨床應(yīng)用。對(duì)吉西他濱N4位進(jìn)行修飾和改造，可以減緩代謝失活，增加抗腫瘤活性，降低毒副作用。在實(shí)驗(yàn)室前期工作中，以酰胺鍵將bestatin連接到吉西他濱N4位的氨基上，形成協(xié)同前藥BC-A1。初步活性研究證明了BC-A1在體外對(duì)APN酶具有良好的抑制活性。在本課題的第二部分中，我們從多個(gè)方面評(píng)價(jià)了化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分

4、吲哚-2，3-酮類APN抑制劑LJNK的抗癌活性研究
　　本課題從以下方面對(duì)化合物L(fēng)JNK抗腫瘤活性進(jìn)行了研究:
　　(1)LJNK與APN的相互作用:LJNK在和APN的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)中，與酶的活性位點(diǎn)有效結(jié)合。用分光光度法測(cè)定了LJNK在體外對(duì)APN酶的抑制活性，實(shí)驗(yàn)證明，LJNK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合APN，抑制作用優(yōu)于bestatin。
　　(2)體外抗血管生成活性:HUVEC二維管實(shí)驗(yàn)和大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)表明，LJNK和be

5、statin劑量依賴性的抑制腫瘤微血管形成，作用強(qiáng)于bestatin。
　　(3)體外抗侵襲活性:transwell實(shí)驗(yàn)表明，LJNK對(duì)腫瘤細(xì)胞ES-2侵襲具有抑制作用，抑制作用的強(qiáng)度稍弱于陽(yáng)性對(duì)照bestatin。
　　(4)體外抗增殖活性:MTT實(shí)驗(yàn)和集落生成實(shí)驗(yàn)都表明，LJNK對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用，作用強(qiáng)度強(qiáng)于bestatin。另外，非腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在有效抗腫瘤濃度下，LJNK對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用

6、非常弱。
　　(5)體內(nèi)抗腫瘤增殖活性:通過(guò)昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型，測(cè)定了LJNK在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制作用。連續(xù)給藥兩周后，LJNK80 mg/kg/d的腫瘤抑制率達(dá)到59.9％，并且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)LJNK有良好的耐受性。
　　(6)初步機(jī)制探討:以流式細(xì)胞術(shù)和熒光拍照的方法檢測(cè)了LJNK對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。LJNK可以濃度依賴性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且活性高于bestatin。進(jìn)一步用免疫印跡和caspase酶活力

7、測(cè)定的方法，證明了LJNK和bestatin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中cleaved caspase3的表達(dá)水平上升，caspase3活力增加。
　　總之，LJNK能夠與APN有效結(jié)合，抑制APN酶活性，從而抑制腫瘤組織新生血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲。LJNK能夠在體內(nèi)外抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。LJNK誘導(dǎo)凋亡與caspase3相關(guān)的凋亡通路有關(guān)。
　　第二部分 基于bestatin和吉西他濱的協(xié)同前藥BC-A1的抗癌活

8、性研究
　　本課題從以下方面對(duì)化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究:
　　(1)APN酶抑制活性:用分光光度法測(cè)定BC-A1對(duì)APN酶的抑制活性。BC-A1和bestatin對(duì)豬腎微粒體APN酶抑制的IC50分別是12.11±2.17μM和4.59±0.43μM。
　　(2)體外抗血管生成作用:用HUVEC形成二維管實(shí)驗(yàn)和大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了BC-A1對(duì)腫瘤組織新生血管形成的抑制作用，活性明顯高于陽(yáng)性對(duì)照be

9、statin。
　　(3)體外抗侵襲活性:用transwell法測(cè)定了BC-A1對(duì)腫瘤細(xì)胞ES-2侵襲能力的影響。BC-A1作用于ES-2細(xì)胞，顯著抑制ES-2細(xì)胞的侵襲。
　　(4)體外抗增殖活性:首先用MTT實(shí)驗(yàn)和集落生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BC-A1、吉西他濱、吉西他濱-bestatin（摩爾比1∶1）、吉西他濱-bestatin(1∶10)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，增加bestatin的濃度并不能顯著增強(qiáng)抗增殖活性。

10、多株腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)證明，BC-A1對(duì)腫瘤的增殖抑制作用與吉西他濱相當(dāng)。
　　(5)體內(nèi)抗增殖活性:通過(guò)昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型，測(cè)定了BC-A1的體內(nèi)抗腫瘤作用?？诜o藥低劑量BC-A1對(duì)腫瘤的體內(nèi)增殖具有良好的抑制作用，與靜脈注射更高劑量吉西他濱取得了相當(dāng)?shù)寞熜А?br>　　(6)誘導(dǎo)凋亡活性:用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2μM的BC-A1作用于PLC/PRF/5細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　總之，BC-A1保留了