靶向微泡介導(dǎo)兔易損斑塊新生血管超聲分子顯像及CXCR4在AS演進(jìn)中的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是影響人類健康的主要疾病，絕大多數(shù)患者在沒有任何前驅(qū)癥狀情況，死于急性心血管事件。近年來研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致急性心血管病事件的主要原因是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和動(dòng)脈血栓形成，而這主要取決于斑塊的易損性(vulnerability)，易損斑塊(vulnerable plaque，VP)及不穩(wěn)定斑塊破裂是導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征重要因素之一。除目前國際公認(rèn)的易損斑塊診斷指

2、標(biāo)：脂質(zhì)池體積、炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量及纖維帽厚度之外，斑塊新生血管密度及分布亦是衡量斑塊易損性和穩(wěn)定性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。新生血管是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊一個(gè)重要病理學(xué)特征，也是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。靶向超聲對比顯像技術(shù)是分子水平顯影成像技術(shù)之一，利用超聲造影劑(微泡)表面固有的生物學(xué)特性，或者通過對微泡表面連接特異性的抗體或配體，構(gòu)建具有靶向能力超聲微泡造影劑，經(jīng)靜脈注入體內(nèi)后靶向性聚集于靶目標(biāo)，對于臨床診斷、治療療效以及藥物開發(fā)等諸

3、多方面均有重要意義。因此，通過具有靶向能力的影像學(xué)技術(shù)檢測斑塊內(nèi)新生血管，在辨識斑塊穩(wěn)定性，預(yù)防心腦血管事件的發(fā)生等方面具有重要作用。
　　 血管內(nèi)皮生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR-2)作為重要的血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的主要受體，VEGFR-2高表達(dá)于易損斑塊新生血管的

4、內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF主要通過兩個(gè)絡(luò)氨酸激酶受體發(fā)揮作用：VEGF receptor-1(Flt-1)和VEGF receptor-2(KDR/Flk-1)，VEGFR-2具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增加血管通透性等作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用生物素-親和素-生物素橋連方法制備攜VEGFR-2單抗靶向微泡造影劑，利用高頻超聲對比造影技術(shù)無創(chuàng)性動(dòng)態(tài)觀測活體兔腹主動(dòng)脈易損斑塊新生血管的增強(qiáng)顯影效果，斑塊顯影強(qiáng)度與相應(yīng)的斑塊VEGFR-2免疫組織化學(xué)染色

5、量化結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，并與血脂水平和病理學(xué)檢查相結(jié)合，初步探討一種檢測易損斑塊新生血管靶向增強(qiáng)顯影的超聲分子成像技術(shù)。
　　 有研究證實(shí)了斑塊內(nèi)血管生成在動(dòng)脈粥樣硬化形成與發(fā)展中具有重要作用，動(dòng)脈粥樣硬化中的新生血管大部分為不成熟，周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞數(shù)量缺乏，其通透性較大，有利于炎癥細(xì)胞滲透進(jìn)入斑塊內(nèi)部，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，增加斑塊不穩(wěn)定性與易損性。因此，深入研究和理解動(dòng)脈粥樣硬化血管生成的過程及其調(diào)控機(jī)理，對于促進(jìn)抗血管生成治

6、療粥樣斑塊，增加斑塊穩(wěn)定性都具有重要意義。趨化因子是一類超家族的細(xì)胞因子，由于基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell derived factor1α，SDF-1α)靠近N端的2個(gè)半胱氨酸被一個(gè)其他的氨基酸隔開而被歸為CXC亞家族。它的唯一受體是趨化因子受體4(chemokine receptor4，CXCR4)，CXCR4在單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、平滑肌中均有表達(dá)，它們都是與動(dòng)脈粥樣硬化形成過程相關(guān)的主要細(xì)胞成分。有研究發(fā)現(xiàn)CXC

7、R4能促進(jìn)腫瘤組織轉(zhuǎn)移及血管形成，但它在動(dòng)脈粥樣硬化血管生成中的研究鮮有報(bào)道。本研究通過建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，檢測不同時(shí)間點(diǎn)趨化因子受體CXCR4與血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達(dá)變化及其相關(guān)性，初步探討趨化因子受體CXCR4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血管生成中的作用及可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.短肽GL-7靶向微泡造影劑對高脂飲食兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜體外特異性結(jié)合及體內(nèi)增強(qiáng)顯影效果：
　　 高脂飲食法建立兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜損

8、傷模型后隨機(jī)分為兩組：分別使用靶向和非靶向微泡造影劑行腹主動(dòng)脈超聲造影觀察。視頻密度法評價(jià)兩種造影劑對動(dòng)脈內(nèi)膜增強(qiáng)顯影效果。免疫熒光染色觀察兩種造影劑與動(dòng)脈內(nèi)膜特異性結(jié)合及熒光染色強(qiáng)度差異。
　　 2.VEGFR-2靶向微泡造影劑介導(dǎo)兔腹主動(dòng)脈易損斑塊新生血管超聲分子顯像：
　　 采用球囊損傷血管內(nèi)皮+高脂飼料喂養(yǎng)+p53腺病毒轉(zhuǎn)染的方法，模擬人類易損斑塊病理學(xué)特點(diǎn)，建立兔腹主動(dòng)脈易損斑塊模型，利用高頻超聲對比造影技術(shù)無

9、創(chuàng)性動(dòng)態(tài)觀測活體兔腹主動(dòng)脈易損斑塊新生血管增強(qiáng)顯影效果，斑塊顯影強(qiáng)度與相應(yīng)的斑塊VEGFR-2免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，并與血脂水平和病理學(xué)檢查相結(jié)合。
　　 3.兔動(dòng)脈血管中趨化因子受體CXCR4與血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達(dá)變化及其相關(guān)性：
　　 新西蘭大白兔高脂飼料喂養(yǎng)+球囊拉傷腹主動(dòng)脈法建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，分別于第4、8、12周末處死動(dòng)物，截取腹主動(dòng)脈血管，蛋白質(zhì)印跡Western Blot法檢測CXCR

10、4蛋白含量變化。熒光定量PCR法檢測VEGFmRNA表達(dá)變化，結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組織化學(xué)染色法檢測動(dòng)脈粥樣硬化斑塊CXCR4、CD34表達(dá)與定位。
　　 結(jié)果：
　　 1.靶向、非靶向微泡造影劑造影后血管內(nèi)膜回聲均較造影前增強(qiáng)，靶向造影組較非靶向造影組血管內(nèi)膜峰值視頻強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(137.49±13，56 dB vs111.24±15.23 dB；P<0.05)。熒光顯微鏡下觀察，靶向微泡造影組

11、與動(dòng)脈內(nèi)膜特異性結(jié)合呈明亮綠色熒光表達(dá)，而非靶向造影組內(nèi)膜面呈微弱綠色熒光，兩組熒光強(qiáng)度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(76.74±13.64 vs31.17±14.81；P<0.05)。
　　 2.生物素-親和素法成功制備VEGFR-2靶向微泡造影劑。建立兔腹主動(dòng)脈易損斑塊模型具有人類易損斑塊基本病理學(xué)特點(diǎn)。12周末，靶向微泡造影組視頻強(qiáng)度與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(144.42±17.70 dB vs106.88±9.38dB；Z=-3

12、.984，P=0.000)。靶向VEGFR-2微泡造影組動(dòng)脈斑塊視頻強(qiáng)度與相應(yīng)VEGFR-2免疫組織化學(xué)陽性表達(dá)呈顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)(r2=0.78，P=0.001)，而與此相反在對照組，Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明與相應(yīng)VEGFR-2表達(dá)水平之間無相關(guān)關(guān)系，Pearson相關(guān)系數(shù)((r2=0.17，P=0.301)。
　　 3.兔動(dòng)脈粥樣硬化模型第4、8、12周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)動(dòng)脈血管CXCR4蛋白含量分別為：(0

13、.46±0.03)、(0.58±0.05)、(0.65±0.07)；動(dòng)脈血管VEGF mRNA表達(dá)為(1.04±0.24)、(1.99±0.21)、(3.97±0.75)，兩者之間呈顯著正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r2=0.869，P<0.05)。免疫組織化學(xué)CXCR4染色在血管內(nèi)膜及斑塊內(nèi)部可見多處陽性染色，CD34陽性染色于血管內(nèi)皮細(xì)胞，動(dòng)脈斑塊內(nèi)可見豐富的新生血管，棕黃色陽性表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.短肽G

14、L-7靶向微泡造影劑與兔動(dòng)脈血管內(nèi)膜體內(nèi)、體外特異性結(jié)合，并可顯著增強(qiáng)高脂飲食兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜靶向增強(qiáng)顯影。
　　 2.VEGFR-2靶向超聲對比分子顯像的方法對觀察兔易損斑塊新生血管表達(dá)具有良好的相關(guān)性與特異性，為采用靶向超聲分子顯像的方法在體無創(chuàng)性評估兔易損斑塊新生血管奠定了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 3.兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中，趨化因子受體CXCR4和血管內(nèi)皮生長VEGF表達(dá)含量呈正相關(guān)，趨化因子受體CXCR4可能在斑