超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)PHD2-shRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)血管生成因子表達的研究.pdf

1、缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)是一種最常見的心血管疾病,已成為威脅人類生命健康主要疾病之一。目前,國內(nèi)外常用的ICM治療方法包括藥物治療、介入治療及外科治療,但少數(shù)病人由于心肌病變彌漫,導(dǎo)致上述方法治療效果不佳。隨著心血管疾病發(fā)病機制分子水平研究的深入,“治療性血管生成(therapeutic angiogenesis)”基因療法已成為ICM治療的新方法。血管新生作為一個新的治療途徑可以增加缺血心

2、肌的血流灌注,成了ICM治療研究的熱點。
　　經(jīng)過多年研究,基因治療在疾病治療中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。但疾病基因治療的成功必需安全高效的基因載體和基因輸送工具。病毒載體能夠容易地促進外源性基因轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染率較佳,但存在安全隱患。非病毒載體安全、大容量和制備容易,有望較病毒載體具有更好的研究應(yīng)用,但基因轉(zhuǎn)染效率低。因此尋求一種安全有效的基因轉(zhuǎn)染途徑成為目前該領(lǐng)域研究的重點。隨著超聲造影劑作為一種新型基因載體可行性研究的逐步深入和超聲介

3、導(dǎo)微泡破壞增強基因轉(zhuǎn)染機制認識的不斷加深,超聲靶向微泡破碎介導(dǎo)基因治療應(yīng)用日益廣泛。但關(guān)鍵問題是超聲輻照微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染某些細胞及體內(nèi)組織或器官等效果不理想,難以滿足臨床治療的需要。PEI是一種對無毒的商品化非病毒載體,可以提高基因?qū)毎D(zhuǎn)染效率。為此,本實驗應(yīng)用超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染H9C2細胞誘導(dǎo)治療性血管生成因子表達。
　　雖然大量研究證明超聲輻照微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的可行性及有效性,但超聲輻照微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染細

4、胞需要參數(shù)優(yōu)化,以達到最大轉(zhuǎn)染效率且使細胞死亡最小。另外超聲輻照介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是否能夠成功表達需要體外驗證,為體內(nèi)試驗打下基礎(chǔ)。本實驗的研究目的是優(yōu)化超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染H9C2細胞的參數(shù)及在最佳參數(shù)下介導(dǎo)PHD2-shRNA轉(zhuǎn)染常氧和缺氧H9C2細胞,驗證PHD2-shRNA能夠沉默PHD2,促進HIF-1α及下游血管生成因子表達的可行性,從而為超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)PHD2-shRNA治療大鼠心肌梗塞模型打下

5、基礎(chǔ)。本實驗分為兩部分。
　　第一部分：超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9C2心肌細胞參數(shù)優(yōu)化
　　目的：探討不同超聲輻照參數(shù)對基因轉(zhuǎn)染的作用,優(yōu)化超聲輻照參數(shù)提高基因轉(zhuǎn)染效率,與此同時減少對細胞活性影響。
　　方法：體外培養(yǎng)H9C2心肌細胞,隨機分為6組:(1)單純質(zhì)粒組(C);(2)超聲(U)+微泡(M)組;(3)PEI(P)組;(4)P+M組;(5)P+U組;(6)P+U+M組。任意選取參數(shù)進行轉(zhuǎn)

6、染,轉(zhuǎn)染12h、24h、48h及72h后熒光顯微鏡觀察H9C2心肌細胞中綠色熒光蛋白質(zhì)的表達。熒光蛋白表達最佳組設(shè)置不同參數(shù),即改變超聲強度、微泡濃度、輻照時間及質(zhì)粒濃度等進行轉(zhuǎn)染,輻照后以臺盼藍染色測定細胞存活率,流式細胞儀測EGFP質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染率,取得最佳的轉(zhuǎn)染參數(shù)。
　　結(jié)果：上述各組在12h、24h、48h及72h熒光顯微鏡觀察均可見熒光顯示,但48h表達最強,其中P+U+M組相對其它組綠色熒光蛋白質(zhì)的表達最多。P+U+M

7、組設(shè)置不同參數(shù)進行轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn),超聲輻照時間及質(zhì)粒濃度一定時,隨著超聲強度及微泡濃度的增加,基因轉(zhuǎn)染效率逐漸增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義。但微泡濃度超過30％,超聲輻照強度超過1.5W/cm2后基因轉(zhuǎn)染效率不再升高,細胞死亡率明顯增加(P<0.05)。固定超聲強度(1.5W/cm2、微泡濃度(30%)和質(zhì)粒濃度(8μg/ml),改變時間(15s、30s、45s、60s),結(jié)果顯示超聲輻照時間30s時轉(zhuǎn)染效率最高(P<0.05),細胞死亡率相對較少

8、。超聲強度(1.5W/cm2)、微泡濃度(30%)及輻照時間(30s)不變時,隨著質(zhì)粒濃度的增加,基因轉(zhuǎn)染效率增加,但質(zhì)粒濃度增加到16μg/ml時轉(zhuǎn)染效率不再增加,而增加質(zhì)粒濃度對細胞存活率無影響。
　　結(jié)論：超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI能顯著增強EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9C2心肌細胞。根據(jù)不同參數(shù)轉(zhuǎn)染后,30%的造影劑濃度、1.5W/cm2的聲強、30s的輻照時間、16μg/ml細胞轉(zhuǎn)染效率最高,是H9C2心肌細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。

9、r>　　第二部分：超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)PHD2-shRNA轉(zhuǎn)染H9C2細胞誘導(dǎo)治療性血管生成因子表達
　　目的：構(gòu)建靶向PHD2基因的shRNA真核表達載體,應(yīng)用超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)PHD2-shRNA轉(zhuǎn)染H9C2心肌細胞以探討PHD2-shRNA對PHD2基因的沉默效應(yīng),及其促進HIF-1α及下游促血管生成因子(VEGF、TGF-β及bFGF)基因表達的可行性。
　　方法:構(gòu)建靶向PHD2基因的shRN

10、A真核表達質(zhì)粒及對照質(zhì)粒(單純EGFP質(zhì)粒)。體外常氧、缺氧培養(yǎng)H9C2心肌細胞,分為4組:(1)對照質(zhì)粒常氧組;(2)PHD2-shRNA常氧組;(3)對照質(zhì)粒缺氧組;(4)PHD2-shRNA缺氧組。超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導(dǎo)PHD2-shRNA和對照質(zhì)粒分別對上述各組進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡觀察H9C2細胞中的熒光蛋白表達。Westernblot檢測PHD2、HIF-1α蛋白表達水平,RT-PCR檢測VEGF、TGF-

11、β及bFGF的mRNA表達水平。
　　結(jié)果：測序分析證實PHD2-shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;48小時后上述4組熒光顯微鏡下均可見熒光蛋白表達,強度無明顯差異。Western-blot檢測結(jié)果顯示,PHD2-shRNA常氧和缺氧組PHD2蛋白條帶亮度均明顯低于相對應(yīng)對照質(zhì)粒常氧和缺氧組,而PHD2-shRNA常氧和缺氧組HIF-1α蛋白條帶亮度明顯高于相對應(yīng)對照質(zhì)粒常氧和缺氧組。對照質(zhì)粒常氧組、PHD2-shRNA常氧組、對照質(zhì)粒

12、缺氧組和PHD2-shRNA缺氧組PHD2/GAPDH吸光度比值、HIF-1α/GAPDH吸光度比值兩兩之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR分析顯示PHD2-shRNA常氧和缺氧組VEGF、TGF-β和bFGFmRNA條帶亮度明顯高于相對應(yīng)對照質(zhì)粒常氧和缺氧組,各組之間不同指標兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：超聲靶向微泡破碎介導(dǎo)PHD2-shRNA基因轉(zhuǎn)染H9C2細胞后,可顯著下調(diào)PHD