超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導PHD2-shRNA轉染誘導血管生成因子表達的研究.pdf

1、缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)是一種最常見的心血管疾病,已成為威脅人類生命健康主要疾病之一。目前,國內(nèi)外常用的ICM治療方法包括藥物治療、介入治療及外科治療,但少數(shù)病人由于心肌病變彌漫,導致上述方法治療效果不佳。隨著心血管疾病發(fā)病機制分子水平研究的深入,“治療性血管生成(therapeutic angiogenesis)”基因療法已成為ICM治療的新方法。血管新生作為一個新的治療途徑可以增加缺血心

2、肌的血流灌注,成了ICM治療研究的熱點。
　　經(jīng)過多年研究,基因治療在疾病治療中展現(xiàn)出良好的應用前景。但疾病基因治療的成功必需安全高效的基因載體和基因輸送工具。病毒載體能夠容易地促進外源性基因轉染,轉染率較佳,但存在安全隱患。非病毒載體安全、大容量和制備容易,有望較病毒載體具有更好的研究應用,但基因轉染效率低。因此尋求一種安全有效的基因轉染途徑成為目前該領域研究的重點。隨著超聲造影劑作為一種新型基因載體可行性研究的逐步深入和超聲介

3、導微泡破壞增強基因轉染機制認識的不斷加深,超聲靶向微泡破碎介導基因治療應用日益廣泛。但關鍵問題是超聲輻照微泡介導基因轉染某些細胞及體內(nèi)組織或器官等效果不理想,難以滿足臨床治療的需要。PEI是一種對無毒的商品化非病毒載體,可以提高基因對細胞轉染效率。為此,本實驗應用超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導基因轉染H9C2細胞誘導治療性血管生成因子表達。
　　雖然大量研究證明超聲輻照微泡介導基因轉染的可行性及有效性,但超聲輻照微泡介導基因轉染細

4、胞需要參數(shù)優(yōu)化,以達到最大轉染效率且使細胞死亡最小。另外超聲輻照介導基因轉染是否能夠成功表達需要體外驗證,為體內(nèi)試驗打下基礎。本實驗的研究目的是優(yōu)化超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導基因轉染H9C2細胞的參數(shù)及在最佳參數(shù)下介導PHD2-shRNA轉染常氧和缺氧H9C2細胞,驗證PHD2-shRNA能夠沉默PHD2,促進HIF-1α及下游血管生成因子表達的可行性,從而為超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導PHD2-shRNA治療大鼠心肌梗塞模型打下

5、基礎。本實驗分為兩部分。
　　第一部分：超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導EGFP質粒轉染H9C2心肌細胞參數(shù)優(yōu)化
　　目的：探討不同超聲輻照參數(shù)對基因轉染的作用,優(yōu)化超聲輻照參數(shù)提高基因轉染效率,與此同時減少對細胞活性影響。
　　方法：體外培養(yǎng)H9C2心肌細胞,隨機分為6組:(1)單純質粒組(C);(2)超聲(U)+微泡(M)組;(3)PEI(P)組;(4)P+M組;(5)P+U組;(6)P+U+M組。任意選取參數(shù)進行轉

6、染,轉染12h、24h、48h及72h后熒光顯微鏡觀察H9C2心肌細胞中綠色熒光蛋白質的表達。熒光蛋白表達最佳組設置不同參數(shù),即改變超聲強度、微泡濃度、輻照時間及質粒濃度等進行轉染,輻照后以臺盼藍染色測定細胞存活率,流式細胞儀測EGFP質粒瞬時轉染率,取得最佳的轉染參數(shù)。
　　結果：上述各組在12h、24h、48h及72h熒光顯微鏡觀察均可見熒光顯示,但48h表達最強,其中P+U+M組相對其它組綠色熒光蛋白質的表達最多。P+U+M

7、組設置不同參數(shù)進行轉染后發(fā)現(xiàn),超聲輻照時間及質粒濃度一定時,隨著超聲強度及微泡濃度的增加,基因轉染效率逐漸增加,具有統(tǒng)計學意義。但微泡濃度超過30％,超聲輻照強度超過1.5W/cm2后基因轉染效率不再升高,細胞死亡率明顯增加(P<0.05)。固定超聲強度(1.5W/cm2、微泡濃度(30%)和質粒濃度(8μg/ml),改變時間(15s、30s、45s、60s),結果顯示超聲輻照時間30s時轉染效率最高(P<0.05),細胞死亡率相對較少

8、。超聲強度(1.5W/cm2)、微泡濃度(30%)及輻照時間(30s)不變時,隨著質粒濃度的增加,基因轉染效率增加,但質粒濃度增加到16μg/ml時轉染效率不再增加,而增加質粒濃度對細胞存活率無影響。
　　結論：超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI能顯著增強EGFP質粒轉染H9C2心肌細胞。根據(jù)不同參數(shù)轉染后,30%的造影劑濃度、1.5W/cm2的聲強、30s的輻照時間、16μg/ml細胞轉染效率最高,是H9C2心肌細胞的最佳轉染條件。

9、r>　　第二部分：超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導PHD2-shRNA轉染H9C2細胞誘導治療性血管生成因子表達
　　目的：構建靶向PHD2基因的shRNA真核表達載體,應用超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導PHD2-shRNA轉染H9C2心肌細胞以探討PHD2-shRNA對PHD2基因的沉默效應,及其促進HIF-1α及下游促血管生成因子(VEGF、TGF-β及bFGF)基因表達的可行性。
　　方法:構建靶向PHD2基因的shRN

10、A真核表達質粒及對照質粒(單純EGFP質粒)。體外常氧、缺氧培養(yǎng)H9C2心肌細胞,分為4組:(1)對照質粒常氧組;(2)PHD2-shRNA常氧組;(3)對照質粒缺氧組;(4)PHD2-shRNA缺氧組。超聲靶向微泡破碎聯(lián)合PEI介導PHD2-shRNA和對照質粒分別對上述各組進行轉染。轉染48h后熒光顯微鏡觀察H9C2細胞中的熒光蛋白表達。Westernblot檢測PHD2、HIF-1α蛋白表達水平,RT-PCR檢測VEGF、TGF-

11、β及bFGF的mRNA表達水平。
　　結果：測序分析證實PHD2-shRNA重組質粒構建成功;48小時后上述4組熒光顯微鏡下均可見熒光蛋白表達,強度無明顯差異。Western-blot檢測結果顯示,PHD2-shRNA常氧和缺氧組PHD2蛋白條帶亮度均明顯低于相對應對照質粒常氧和缺氧組,而PHD2-shRNA常氧和缺氧組HIF-1α蛋白條帶亮度明顯高于相對應對照質粒常氧和缺氧組。對照質粒常氧組、PHD2-shRNA常氧組、對照質粒

12、缺氧組和PHD2-shRNA缺氧組PHD2/GAPDH吸光度比值、HIF-1α/GAPDH吸光度比值兩兩之間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RT-PCR分析顯示PHD2-shRNA常氧和缺氧組VEGF、TGF-β和bFGFmRNA條帶亮度明顯高于相對應對照質粒常氧和缺氧組,各組之間不同指標兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：超聲靶向微泡破碎介導PHD2-shRNA基因轉染H9C2細胞后,可顯著下調(diào)PHD