組織因子途徑抑制物-2相互作用蛋白的篩選及在急性肺損傷中的作用.pdf

1、組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)又稱(chēng)胎盤(pán)蛋白-5(placenta proteln-5，PP-5)和基質(zhì)相關(guān)絲氨酸蛋白酶抑制劑(matrix associated serine protease inhibitor，MSPI)，是一種帶有kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員。成熟的人TFPI-2由富含酸性氨基酸的N端、三個(gè)串聯(lián)的ku

2、ntiz結(jié)構(gòu)域和富含堿性氨基酸的C端組成，能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、組織蛋白酶G和多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性，從而對(duì)抗多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。TFPI-2與同家族的組織因子途徑抑制物-1(TFPI-1)結(jié)構(gòu)相似，功能部分相同，也是一種重要的抗凝物質(zhì)，對(duì)凝血因子VIIa(FVIIa)/組織因子(tissuefactor，TF)復(fù)合物、凝血因子X(jué)a(FXa)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和尿型纖溶酶原

3、激活物(uPA)等均有不同的抑制作用。但迄今為止，TFPI-2的生理功能尚不清楚，TFPI-2與其它蛋白質(zhì)相互作用的信息也知之有限。
　　 我們運(yùn)用Matchmaker酵母雙雜交系統(tǒng)3，構(gòu)建了pGBKT7/TFPI-2質(zhì)粒載體。以此質(zhì)粒為誘餌，從人胎腦cDNA文庫(kù)中篩選出了95個(gè)蛋白編碼基因，包括32個(gè)代謝相關(guān)基因(其中8個(gè)參與蛋白代謝，13個(gè)參與核酸代謝，11個(gè)參與糖代謝)，21個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因，5個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)與生存相關(guān)基因，

4、7個(gè)運(yùn)輸相關(guān)基因，2個(gè)抗調(diào)亡相關(guān)基因，其余28個(gè)基因的功能不明確。通過(guò)分析相關(guān)蛋白的細(xì)胞定位、已知功能及文庫(kù)載體在雙雜交系統(tǒng)中正確表達(dá)的可能性等，進(jìn)一步確定了8個(gè)可能與TFPI-2有潛在相互作用的蛋白。
　　 除篩選與TFPI-2相互作用的蛋白質(zhì)外，我們對(duì)TFPI-2在急性肺損傷(acutelung injury，ALI)中的作用甚感興趣。ALI是機(jī)體遭受?chē)?yán)重感染、創(chuàng)傷、輸血、休克、酸中毒及有害氣體吸入等多種因素打擊后，出現(xiàn)彌漫

5、性肺泡-毛細(xì)血管膜損傷，以廣泛滲出性肺水腫和微小肺不張等為病理特征的臨床綜合征。ALI病因復(fù)雜，起病急驟，發(fā)病持續(xù)，存在從輕到重的連續(xù)病變過(guò)程。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)屬重癥ALI，是臨床上常見(jiàn)的危重性疾病。由于ALI發(fā)病機(jī)制不甚明確，迄今缺乏有效的治療策略和手段，死亡率一直居高不下，病死率高達(dá)40-60％。
　　 急性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是最早發(fā)現(xiàn)的ALI病理變化，貫穿于ALI始終，解釋了ALI的多種病理現(xiàn)象。近年來(lái)，凝血機(jī)制倍

6、受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)ALI許多病理變化與凝血異常相關(guān)，如血栓形成、纖維蛋白沉積、出血和彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等，甚至有人提出ALI特征性病理變化一透明膜的形成也與凝血異常有關(guān)。
　　 既往研究表明，在ALI發(fā)生過(guò)程中，肺組織中許多促凝因子表達(dá)明顯升高，如組織因子(TF)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)等；而抗凝因子的表達(dá)降低或無(wú)明顯變化，如TFPI-1。但TFPI-2在ALI中的變化及作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們觀察了TFP

7、I-2在小鼠ALI發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及與肺組織中凝血因子和炎癥因子之間的關(guān)系。
　　 我們采用尾靜脈注射內(nèi)毒素法成功建立了小鼠ALI動(dòng)物模型。病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示，ALI小鼠肺組織在內(nèi)毒素處理后的不同時(shí)間里，出現(xiàn)了明顯的毛細(xì)血管充血、炎性細(xì)胞侵潤(rùn)、肺泡水腫、血栓形成、纖維蛋白在肺泡壁及間質(zhì)沉積、透明膜形成、肺組織實(shí)變、出血和DIC等一系列炎癥級(jí)聯(lián)和凝血異常的病理變化。我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化方法測(cè)定了ALI小鼠肺組

8、織中的TFPI-2、TFPI-1、TF和炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)TFPI-2在ALI小鼠肺組織中明顯升高，其變化呈現(xiàn)時(shí)間依從性，在內(nèi)毒素處理后2h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，12h時(shí)基本恢復(fù)到初始水平。TFPI-2的動(dòng)態(tài)變化模式與重要炎癥因子IL-1β和TNF-α的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式相似，且兩兩之間呈明顯正相關(guān)，TFPI-2在ALI中隨IL-1β和TNF-α的變化而變化。此外，我們發(fā)現(xiàn)TF在內(nèi)毒素處理6h后開(kāi)始

9、上升，12h達(dá)到高峰；而TFPI-1在內(nèi)毒素處理的初期即呈下降趨勢(shì)，10h時(shí)明顯低于正常水平且達(dá)到最低值，隨后逐步回升，但直到24 h仍未回到正常水平。讓人驚奇的是，ALI中TFPI-2的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式與TF和TFPI-1明顯不同，肺組織中TF/TFPI-2的摩爾比在內(nèi)毒素處理后2h和6h明顯低于對(duì)照組，表明此時(shí)TFPI-2的表達(dá)量明顯高于TF；而TF/TFPI-1的摩爾比在內(nèi)毒素處理后6h、10h和12h明顯高于對(duì)照組，提示該階段TF的