去甲斑蝥素對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管生成的抑制效應(yīng).pdf

1、目的：探討去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)對(duì)人真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells，HDLEC)的增殖、遷徙的抑制殺傷作用和對(duì)體外HDLEC三維培養(yǎng)形成的淋巴管生成的抑制作用及其相關(guān)分子機(jī)制，以尋找一種安全、有效、實(shí)用的“抗淋巴管生成”制劑。
　　 方法：①通過HDLEC二維培養(yǎng)，應(yīng)用MTT法計(jì)算NCTD對(duì)HDLEC的半數(shù)有效濃度(IC50)和細(xì)

2、胞毒作用；應(yīng)用Hoechst33258熒光染色、流式細(xì)胞儀、劃線法和倒置顯微鏡、透射電鏡檢測(cè)、觀察NCTD對(duì)HDLEC增殖、遷移的抑制、直接殺傷和誘導(dǎo)凋亡作用。②通過HDLEC三維培養(yǎng)，建立HDLEC體外模擬的淋巴管生成模型，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察NCTD對(duì)淋巴管生成的抑制、破壞作用和對(duì)形態(tài)學(xué)的影響。③應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、Western-blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定NCTD對(duì)HDLEC三維培養(yǎng)體外模擬淋巴管生成過程中淋巴管生成因子VE

3、GF-C、VEGF-D及其受體VEGFR-3蛋白/mRNA表達(dá)的影響，探討NCTD的“抗淋巴管生成”相關(guān)分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：①M(fèi)TT法測(cè)得不同濃度和時(shí)間的NCTD對(duì)HDLEC的增殖和生長(zhǎng)有明顯的抑制和殺傷作用(P＜0.01)，其半數(shù)有效濃度(IC50)為0.0068mg.ml-1:②應(yīng)用Hoechst染色+流式細(xì)胞分析、倒置顯微鏡、透射電鏡以及劃線法，可觀察到NCTD對(duì)HDLEC的形態(tài)和細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制和直接殺傷作用

4、，并能促進(jìn)、誘導(dǎo)HDLEC凋亡，其作用隨NCTD濃度/時(shí)間的增加/延長(zhǎng)而加強(qiáng)(P＜0.01)，同時(shí)可見NCTD對(duì)HDLEC的遷移亦有顯著的抑制作用(P＜0.01)；③在HDLEC體外三維培養(yǎng)、成功建立HDLEC淋巴管生成模型的基礎(chǔ)上，可觀察到由NCTD引起的淋巴管生成形態(tài)學(xué)改變，即NCTD對(duì)體外正在形成和已形成的淋巴管生成有明顯的抑制和破壞作用；④經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、Western-blot檢測(cè)，應(yīng)用NCTD(NCTD組)和聯(lián)合應(yīng)用NCTD

5、與VEGFR-3抗體(NCTD+VEGFR-3抗體組)可使HDLEC三維培養(yǎng)形成的淋巴管生成中的VEGF-C、VEGF-D蛋白表達(dá)明顯降低(與空白對(duì)照組比較，P＜0.01;但VEGFR-3無差異，P＞0.05)，而單純VEGFR-3抗體組VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析則顯示，NCTD組、NCTD+VEGFR-3抗體組的VEGF-CmRNA、VEGF-D mRNA、VEGF

6、R-3 mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：①NCTD對(duì)人HDLEC的增殖、遷移具有顯著的抑制、直接殺傷和誘導(dǎo)凋亡作用，并呈濃度/時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。②NCTD對(duì)體外HDLEC三維培養(yǎng)正在形成和已形成的淋巴管生成具有明顯的抑制和破壞作用。③NCTD可在蛋白或基因水平使HDLEC三維培養(yǎng)形成淋巴管生成過程中的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)下降。④NCTD的抗淋巴管生成效應(yīng)，可能與NCTD直接抑制淋巴管內(nèi)