上皮性卵巢腫瘤相關微淋巴管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)及其特性研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：上皮性卵巢腫瘤中微淋巴管內(nèi)皮細胞的存在及其分布特點
　　 目的：研究上皮性卵巢腫瘤中微淋巴管內(nèi)皮細胞的存在及其分布特點，探討從上皮性卵巢腫瘤單細胞懸液中分離微淋巴管內(nèi)皮細胞的可行性。
　　 方法：(1)淋巴管內(nèi)皮細胞標記分子D2-40 相關免疫組織化學染色檢測15例上皮性卵巢腫瘤（其中惡性10例，交界性5例）中微淋巴管的密度（lymphatic vessels density，

2、LVD）和微淋巴管所占的面積百分比（lymphatic vessels area，LVA）；D2-40/Ki-67 相結合雙標免疫組織化學方法檢測有無增生狀態(tài)的微淋巴管內(nèi)皮細胞。(2)流式細胞儀分別檢測前述15例上皮性卵巢腫瘤新鮮組織，5例良性上皮性卵巢腫瘤和5例正常卵巢組織新鮮組織中淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（(lymphatic vessel endothelialHA receptor-1，LYVE-1）陽性細胞的比例。
　

3、　 結果：(1)交界性卵巢腫瘤中的LVD 為(13.23±8.26)條/4HP，與惡性腫瘤(14.22±7.21)條/4HP 相比無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。但是惡性上皮性腫瘤中LVA 為（3.52±1.61）%較交界性卵巢腫瘤(2.21±1.42)%明顯升高（P＜0.05）。Ki-67 在D2-40(+)的淋巴管內(nèi)皮細胞中無表達。⑵卵巢上皮腫瘤組織單細胞懸液中LYVE-1(+)細胞的比例為2-11%，惡性與交界性組織相比無顯著

4、統(tǒng)計學差異，但是比例較正常和良性卵巢腫瘤組織高（P<0.05）。
　　 結論：惡性和交界性卵巢腫瘤中存在微淋巴管內(nèi)皮細胞，二者之間無顯著差異。
　　 第二部分：體外分離，培養(yǎng)，鑒定上皮性卵巢腫瘤來源的微淋巴管內(nèi)皮細胞及其一般生物學特點
　　 目的：從交界性和惡性上皮性卵巢腫瘤組織中分離微淋巴管內(nèi)皮細胞，體外進行培養(yǎng)，鑒定和純化，研究該細胞的一般生物學特性。
　　 方法：⑴膠原酶消化26例新鮮卵巢腫瘤（其中

5、交界性11例和惡性15例）組織得到單細胞懸液，免疫磁珠分選其中的LYVE-1(+)細胞體外貼壁進行二維和三維培養(yǎng)。⑵應用泛內(nèi)皮細胞標記分子CD31和多種淋巴內(nèi)皮細胞標記分子如Prox-1，D2-40，VEGFR-3和LYVE-1 鑒定該細胞。⑶持續(xù)傳代培養(yǎng)該細胞，嘗試不同條件下的效果，探討其生長的規(guī)律。⑷結合臨床資料分析影響實驗成功的因素。
　　 結果：⑴應用免疫磁珠技術可以成功分離到上皮性卵巢腫瘤細胞中的LYVE-1(+)細胞

6、并體外培養(yǎng)傳代。⑵該細胞表達CD31，Prox-1，D2-40，VEGFR-3和LYVE-1，經(jīng)聯(lián)合鑒定其純度在90%以上。⑶上皮性卵巢腫瘤來源的微淋巴管內(nèi)皮細胞可以傳6 代以上并維持基本性狀。⑷實驗的成功率與患者年齡密切相關，年齡<30歲者成功率顯著升高（P<0.05）。與病理類型無顯著關聯(lián)（P>0.05）。
　　 結論：應用免疫磁珠技術可以從卵巢腫瘤中分離培養(yǎng)微淋巴管內(nèi)皮細胞，該細胞體外性狀穩(wěn)定，可以用于后續(xù)實驗的研究。

7、r>　　 第三部分：上皮性卵巢腫瘤來源的微淋巴管內(nèi)皮細胞及其在體外對腫瘤細胞CAOV-3的影響
　　 目的：研究上皮性卵巢腫瘤來源的微淋巴管內(nèi)皮細胞在體外對卵巢癌細胞株增殖，侵襲和遷移能力的影響及其作用機制。
　　 方法：⑴分別培養(yǎng)上皮性卵巢腫瘤來源的腫瘤相關微淋巴管內(nèi)皮細胞（tumor associatedlymphatic endothelial cell，TLEC）和正常新生兒真皮來源的微淋巴管內(nèi)皮細胞（norm

8、al lymphatic endothelial cell，NLEC）。并收集這兩種細胞的上清得到相應的內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基。⑵分別用這兩種條件培養(yǎng)基干預生長旺盛的卵巢癌細胞系CAOV-3，消化后苔盼藍染色計數(shù)了解其對腫瘤細胞增值的影響，Transwell 小室法檢測干預后腫瘤細胞侵襲和遷移能力。⑶ RT-PCR和熒光定量PCR檢測分別受到兩種條件培養(yǎng)基干預后CAOV-3細胞MMP-2. MMP-9，TIMP-1，TIMP-2和CXCR-

9、4的表達水平。⑷明膠酶譜法檢測TLEC和NLEC對腫瘤細胞CAOV-3 分泌轉移相關因子MMP-2和MMP-9的影響。
　　 結果：⑴ TLEC細胞條件培養(yǎng)基可以顯著增強腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。但是該細胞對腫瘤增殖有無影響尚難以確定。⑵ PCR結果表明在mRNA 水平受到TLEC 干預的腫瘤細胞與受到NLEC 干預的細胞相比其表達MMP-9的表達水平顯著升高（P<0.05），同時TIMP-2的表達水平顯著降低（P<0.05）；