藤茶多糖與總黃酮的提取分離及生物活性研究.pdf

1、藤茶是一種集營養(yǎng)、保健和藥用功效于一體的可直接利用的藥食兩用野生植物，廣泛分布于我國長江流域以南的省份。我國目前對藤茶活性成分的研究集中在藤茶黃酮的提取分離與結構鑒定及部分生物活性方面。天然多糖因其廣泛的生物活性而備受關注，植物多糖的來源廣泛、應用于生物體的毒副作用小，對植物多糖的研究已成為食品、醫(yī)藥、保健領域的熱門課題。目前關于藤茶多糖的研究和藤茶黃酮抗腫瘤活性的研究尚未見報道。 本文以藤茶為原料，首次對藤茶水溶性多糖進行提取

2、、分離與純化、結構的初步鑒定及生物活性的研究，并對綜合提取的藤茶總黃酮進行相關生物活性的評價。 主要研究結果如下： 1藤茶多糖的提取研究和多糖與總黃酮綜合提取工藝的探討 經中心組合試驗(CCD)和響應面分析(RSA)，優(yōu)化出藤茶水溶性多糖提取的主要工藝參數：溫度95℃、25：1水料比、提取4h，1次提取多糖得率為4.20％左右(苯酚-硫酸法測多糖含量計)；2次提取率可達97％；醇沉參數為：3倍體積95％EtOH，

3、靜置2h；提取2次，多糖得率約為7.4％(粗品稱重計)。 初步確定藤茶水溶性多糖與總黃酮綜合提取工藝路線為：藤茶粗粉→脫脂脫色→熱水浸提→濾液濃縮→分離總黃酮→沉淀多糖→分離粗多糖。提取2次，總黃酮和粗多糖得率分別達到31.0％和6.6％以上(粗品稱重計)。 2藤茶多糖的分離純化與結構的初步鑒定 藤茶水溶性多糖粗品經Sevag法3次處理，得到初步純化的藤茶多糖AGP，得率約4.5％，AGP蛋白質含量2.0％，多糖

4、含量43.4％。AGP經DEAE-SephadexA-25柱分離出4個級分，其中的AGP-Ⅲ和AGP-Ⅳ組分得率分別約為28.0％和26.0％；再經SephadexG-200柱分離，分別獲得相應主要亞級分AGP-3和AGP-4，得率約為67％和69％。AGP-3和AGP-4經SephadexG-200柱和HPLC鑒定，為相對均一多糖。AGP-3和AGP-4均為白色絮狀的非淀粉多糖；中性糖含量分別為57.6％和46.2％；糖醛酸含量分別為

5、32.3％和45.7％；蛋白質含量分別為3.5％和4.7％。GPC法測定AGP-3和AGP-4的重均分子量，分別為1.02×105和1.82×105。 氣相色譜、紅外光譜和核磁共振光譜法分析AGP-3結構，初步確定：AGP-3主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖及己糖醛酸組成，包括β-(1→4)、β-(1→6)、α-(1→6)幾種糖苷鍵類型，并含有蛋白質。AGP-4的氣相色譜和紅外光譜分析結果與AGP-3相似。 3藤茶多糖的抗氧

6、化活性 經體內體外試驗，從不同層次水平系統(tǒng)研究了藤茶多糖的抗氧化活性。AGP與AGP-3在化學模擬體系中具有清除活性氧的能力；體外可提高小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠紅細胞溶血，抑制小鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成和肝線粒體腫脹，劑量-效應關系較明顯；相同濃度下，AGP的效果優(yōu)于AGP-3；體內AGP對小鼠肝組織MDA的生成有顯著的抑制效果，但對小鼠血清抗活性氧能力沒有明顯的提高。 4藤茶多糖的體內抑瘤效果及增強免疫

7、作用 AGP和AGP-3對小鼠體內S180腫瘤具有一定的抑瘤作用。腹腔注射25～100mg/kg·d，9d，AGP和AGP-3的抑瘤率分別為5.81％～32.56％和2.33％～25.58％，呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系；相同劑量下AGP-3的抑瘤效果弱于AGP；二者均低于陽性對照Cy的抑瘤率(56.98％)。組織病理學觀察，腹腔注射藤茶多糖后的荷瘤小鼠腫瘤組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤、中性粒細胞致腫瘤細胞崩解、成片狀或條狀壞死等現(xiàn)象，AG

8、P作用強于AGP-3。 AGP和AGP-3可提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬率與吞噬指數，增強荷瘤小鼠遲發(fā)型超敏反應，增加其脾細胞抗體形成能力和血清溶血素IgM含量，減輕脾臟指數代償性增大，呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系，中高劑量AGP(50、100mg/kg.d)和高劑量AGP-3(100mg/kg.d)效果顯著，相同劑量下AGP的效果強于AGP-3。一定劑量的藤茶多糖可通過增強荷瘤小鼠的免疫功能，實現(xiàn)體內抑瘤作用。 AGP和

9、AGP-3可顯著抑制荷瘤小鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)活性的升高；提高荷瘤小鼠紅細胞過氧化氫酶(CAT)活性，中高劑量AGP(50、100mg/kg.d)和高劑量AGP-3(100mg/kg.d)組達到極顯著水平。一定劑量的藤茶多糖可以通過抑制LDH活性的升高和促進CAT活性的增強，提高荷瘤小鼠體內的抗氧化能力，達到抑瘤效果。5藤茶多糖對體外人白血病HL-60細胞增殖和細胞凋亡的影響 50～800μg.mL-1范圍內的AGP和50

10、～200μg.mL-1范圍內的AGP-3對體外培養(yǎng)的HL-60細胞沒有明顯的抑制作用；相應濃度AGP和AGP-3與小鼠腹腔巨噬細胞(PM)共同培養(yǎng)的上清液，可明顯抑制HL-60細胞的增殖，呈劑量-效應關系；AGP-3培養(yǎng)上清(PM-AGP)低于同濃度下AGP培養(yǎng)上清(PM-AGP-3)的作用，二者均明顯低于陽性對照VP-16(20μg.mL-1)的效果。 熒光顯微鏡及電鏡觀察，PM-AGP與HL-60細胞培養(yǎng)48h，可見到HL-

11、60細胞凋亡的典型特征，存在劑量-效應關系；流式細胞儀分析，PM-AGP(100、200、400、800μg.mL-1AGP)處理48h，HL-60細胞凋亡率分別為4.91％、6.49％、14.34％、22.02％，表現(xiàn)出一定的劑量-效應關系，但低于VP-16的凋亡率(32.57％)，低濃度PM-AGP(100～200μg.mL-1AGP)與對照組間(4.77％)差異不顯著。 經TNF-α-ELISA試劑盒測定，AGP可增強LP

12、S激活的小鼠腹腔巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子TNF-α的能力，可能是其抑瘤作用的機制之一；免疫組化分析顯示，PM-AGP可下調HL-60細胞中抗凋亡基因bcl-2的蛋白表達。 6綜合工藝提取的藤茶總黃酮抗氧化、調節(jié)血糖和體外抗腫瘤活性 系統(tǒng)研究了藤茶總黃酮(AGTF)的體內外抗氧化活性。鐵氰化鉀還原體系測定還原力，脂氧合酶-亞油酸體系測定抑制氧化酶的效果。AGTF在化學模擬體系中具有清除活性氧的能力；2.0mg.mL-1對脂

13、氧合酶活性的抑制率達到50％以上；體外可提高小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠紅細胞溶血，抑制小鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成和肝線粒體腫脹，劑量-效應關系較明顯。 腹腔注射AGTF(50、100mg/kg.d)12d，使四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖值顯著降低，下降率為20.06％和26.61％，并可顯著升高糖尿病小鼠血清抗活性氧單位和降低小鼠肝勻漿MDA含量。 終濃度25～400μg.mL-1的AGTF對體外培養(yǎng)48h的H