藤茶多糖與總黃酮的提取分離及生物活性研究.pdf

1、藤茶是一種集營養(yǎng)、保健和藥用功效于一體的可直接利用的藥食兩用野生植物，廣泛分布于我國長江流域以南的省份。我國目前對藤茶活性成分的研究集中在藤茶黃酮的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定及部分生物活性方面。天然多糖因其廣泛的生物活性而備受關(guān)注，植物多糖的來源廣泛、應(yīng)用于生物體的毒副作用小，對植物多糖的研究已成為食品、醫(yī)藥、保健領(lǐng)域的熱門課題。目前關(guān)于藤茶多糖的研究和藤茶黃酮抗腫瘤活性的研究尚未見報(bào)道。 本文以藤茶為原料，首次對藤茶水溶性多糖進(jìn)行提取

2、、分離與純化、結(jié)構(gòu)的初步鑒定及生物活性的研究，并對綜合提取的藤茶總黃酮進(jìn)行相關(guān)生物活性的評價(jià)。 主要研究結(jié)果如下： 1藤茶多糖的提取研究和多糖與總黃酮綜合提取工藝的探討 經(jīng)中心組合試驗(yàn)(CCD)和響應(yīng)面分析(RSA)，優(yōu)化出藤茶水溶性多糖提取的主要工藝參數(shù)：溫度95℃、25：1水料比、提取4h，1次提取多糖得率為4.20％左右(苯酚-硫酸法測多糖含量計(jì))；2次提取率可達(dá)97％；醇沉參數(shù)為：3倍體積95％EtOH，

3、靜置2h；提取2次，多糖得率約為7.4％(粗品稱重計(jì))。 初步確定藤茶水溶性多糖與總黃酮綜合提取工藝路線為：藤茶粗粉→脫脂脫色→熱水浸提→濾液濃縮→分離總黃酮→沉淀多糖→分離粗多糖。提取2次，總黃酮和粗多糖得率分別達(dá)到31.0％和6.6％以上(粗品稱重計(jì))。 2藤茶多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)的初步鑒定 藤茶水溶性多糖粗品經(jīng)Sevag法3次處理，得到初步純化的藤茶多糖AGP，得率約4.5％，AGP蛋白質(zhì)含量2.0％，多糖

4、含量43.4％。AGP經(jīng)DEAE-SephadexA-25柱分離出4個級分，其中的AGP-Ⅲ和AGP-Ⅳ組分得率分別約為28.0％和26.0％；再經(jīng)SephadexG-200柱分離，分別獲得相應(yīng)主要亞級分AGP-3和AGP-4，得率約為67％和69％。AGP-3和AGP-4經(jīng)SephadexG-200柱和HPLC鑒定，為相對均一多糖。AGP-3和AGP-4均為白色絮狀的非淀粉多糖；中性糖含量分別為57.6％和46.2％；糖醛酸含量分別為

5、32.3％和45.7％；蛋白質(zhì)含量分別為3.5％和4.7％。GPC法測定AGP-3和AGP-4的重均分子量，分別為1.02×105和1.82×105。 氣相色譜、紅外光譜和核磁共振光譜法分析AGP-3結(jié)構(gòu)，初步確定：AGP-3主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖及己糖醛酸組成，包括β-(1→4)、β-(1→6)、α-(1→6)幾種糖苷鍵類型，并含有蛋白質(zhì)。AGP-4的氣相色譜和紅外光譜分析結(jié)果與AGP-3相似。 3藤茶多糖的抗氧

6、化活性 經(jīng)體內(nèi)體外試驗(yàn)，從不同層次水平系統(tǒng)研究了藤茶多糖的抗氧化活性。AGP與AGP-3在化學(xué)模擬體系中具有清除活性氧的能力；體外可提高小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠紅細(xì)胞溶血，抑制小鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成和肝線粒體腫脹，劑量-效應(yīng)關(guān)系較明顯；相同濃度下，AGP的效果優(yōu)于AGP-3；體內(nèi)AGP對小鼠肝組織MDA的生成有顯著的抑制效果，但對小鼠血清抗活性氧能力沒有明顯的提高。 4藤茶多糖的體內(nèi)抑瘤效果及增強(qiáng)免疫

7、作用 AGP和AGP-3對小鼠體內(nèi)S180腫瘤具有一定的抑瘤作用。腹腔注射25～100mg/kg·d，9d，AGP和AGP-3的抑瘤率分別為5.81％～32.56％和2.33％～25.58％，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；相同劑量下AGP-3的抑瘤效果弱于AGP；二者均低于陽性對照Cy的抑瘤率(56.98％)。組織病理學(xué)觀察，腹腔注射藤茶多糖后的荷瘤小鼠腫瘤組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、中性粒細(xì)胞致腫瘤細(xì)胞崩解、成片狀或條狀壞死等現(xiàn)象，AG

8、P作用強(qiáng)于AGP-3。 AGP和AGP-3可提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率與吞噬指數(shù)，增強(qiáng)荷瘤小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，增加其脾細(xì)胞抗體形成能力和血清溶血素IgM含量，減輕脾臟指數(shù)代償性增大，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，中高劑量AGP(50、100mg/kg.d)和高劑量AGP-3(100mg/kg.d)效果顯著，相同劑量下AGP的效果強(qiáng)于AGP-3。一定劑量的藤茶多糖可通過增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)抑瘤作用。 AGP和

9、AGP-3可顯著抑制荷瘤小鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)活性的升高；提高荷瘤小鼠紅細(xì)胞過氧化氫酶(CAT)活性，中高劑量AGP(50、100mg/kg.d)和高劑量AGP-3(100mg/kg.d)組達(dá)到極顯著水平。一定劑量的藤茶多糖可以通過抑制LDH活性的升高和促進(jìn)CAT活性的增強(qiáng)，提高荷瘤小鼠體內(nèi)的抗氧化能力，達(dá)到抑瘤效果。5藤茶多糖對體外人白血病HL-60細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響 50～800μg.mL-1范圍內(nèi)的AGP和50

10、～200μg.mL-1范圍內(nèi)的AGP-3對體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞沒有明顯的抑制作用；相應(yīng)濃度AGP和AGP-3與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PM)共同培養(yǎng)的上清液，可明顯抑制HL-60細(xì)胞的增殖，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；AGP-3培養(yǎng)上清(PM-AGP)低于同濃度下AGP培養(yǎng)上清(PM-AGP-3)的作用，二者均明顯低于陽性對照VP-16(20μg.mL-1)的效果。 熒光顯微鏡及電鏡觀察，PM-AGP與HL-60細(xì)胞培養(yǎng)48h，可見到HL-

11、60細(xì)胞凋亡的典型特征，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；流式細(xì)胞儀分析，PM-AGP(100、200、400、800μg.mL-1AGP)處理48h，HL-60細(xì)胞凋亡率分別為4.91％、6.49％、14.34％、22.02％，表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但低于VP-16的凋亡率(32.57％)，低濃度PM-AGP(100～200μg.mL-1AGP)與對照組間(4.77％)差異不顯著。 經(jīng)TNF-α-ELISA試劑盒測定，AGP可增強(qiáng)LP

12、S激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子TNF-α的能力，可能是其抑瘤作用的機(jī)制之一；免疫組化分析顯示，PM-AGP可下調(diào)HL-60細(xì)胞中抗凋亡基因bcl-2的蛋白表達(dá)。 6綜合工藝提取的藤茶總黃酮抗氧化、調(diào)節(jié)血糖和體外抗腫瘤活性 系統(tǒng)研究了藤茶總黃酮(AGTF)的體內(nèi)外抗氧化活性。鐵氰化鉀還原體系測定還原力，脂氧合酶-亞油酸體系測定抑制氧化酶的效果。AGTF在化學(xué)模擬體系中具有清除活性氧的能力；2.0mg.mL-1對脂

13、氧合酶活性的抑制率達(dá)到50％以上；體外可提高小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠紅細(xì)胞溶血，抑制小鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成和肝線粒體腫脹，劑量-效應(yīng)關(guān)系較明顯。 腹腔注射AGTF(50、100mg/kg.d)12d，使四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖值顯著降低，下降率為20.06％和26.61％，并可顯著升高糖尿病小鼠血清抗活性氧單位和降低小鼠肝勻漿MDA含量。 終濃度25～400μg.mL-1的AGTF對體外培養(yǎng)48h的H