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文檔簡介
1、蓖麻毒素(ricin)是從植物蓖麻子中分離得到的一種Ⅱ型核糖體失活蛋白,其A鏈(RA)為效應鏈,具有N-糖苷酶活性,通過催化28SrRNAS/R結構域第4324位脫去一個保守的腺嘌呤,使核糖體60S亞基失活,從而阻斷蛋白質合成途徑引起細胞死亡。RA因其高細胞毒性,常常用于制備免疫毒素藥物(ITs),尤其在惡性腫瘤的生物治療上具有誘人的應用前景;或可能被用作恐怖襲擊的生物戰(zhàn)劑。然而,由于RA對哺乳動物細胞的非特異性殺傷作用,不可避免出現(xiàn)一
2、些治療副反應,如血管滲漏綜合癥等。研制針對RA的拮抗分子,有助于緩解這些臨床副作用,并對蓖麻毒素生物恐怖襲擊的偵檢、治療及預防提供必要的理論與實驗依據(jù)。 本研究基于RA與底物相互作用復合物的晶體結構,通過計算機輔助分子設計(CAMD)的方法合理設計了兩類針對RA的拮抗分子,即拮抗肽PT,以及在CDR3區(qū)插入拮抗肽的重組人重鏈單域抗體(rVHPT)。研究內(nèi)容概要如下:1.對重組蓖麻毒素A鏈基因進行了成功的克隆、表達、純化以及功能鑒
3、定,建立了用于篩選RA拮抗分子的生物學評價平臺,即體外細胞毒性實驗與無細胞系中熒光素酶蛋白合成抑制實驗。 2.基于RA的晶體結構信息與定點突變實驗,初步確定以四個氨基酸殘基(E177,R180,Y80,Y123)為主的RA生物活性功能域。針對這一結構域,合理設計了兩類RA拮抗分子,即PT與rVHPT,理論模擬的結果顯示它們能明顯阻斷RA-rRNA相互作用。 3.分別制備合成PT、原核表達rVHPT,并進行競爭ELISA實
4、驗,結果表明二者均能顯著競爭抑制rRA與其相應抗體的結合。無細胞系中熒光素酶蛋白合成抑制實驗的結果表明,給予50%蛋白合成抑制率的rRA用量時,0.1mg/mL的PT即能使蛋白合成率恢復至80%以上。而體外細胞毒性實驗也表明,rVHPT能顯著抑制rRA對SP2/0與SKO-007等的細胞毒性效應。 本研究著重討論了運用計算機輔助分子設計的方法來設計針對RA的拮抗分子,并建立快捷、敏感、穩(wěn)定、定量的生物學評價平臺,為進一步設計更有
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