構(gòu)建表達(dá)蓖麻毒素A鏈與綠色熒光蛋白融合基因研究蓖麻毒素A鏈的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑.pdf

1、[目的] 蓖麻毒素屬于核糖體失活蛋白(ribosomeinactivatingproteins，RIPs)，由A鏈(ricinAchain，RTA)和B鏈組成，其中RTA是活性鏈，B鏈為運(yùn)載體。A鏈由263個氨基酸組成，分子量32000，具有N-糖苷酶活性，能催化28SrRNA在4234位脫去一個腺嘌呤，使核糖體60S亞基失活，從而抑制細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。近年來蓖麻毒素及其A鏈已被用作腫瘤導(dǎo)向藥物——免疫毒素，用于腫

2、瘤和愛滋病的臨床治療，但有關(guān)毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞的途徑目前仍不甚清楚。 綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚蟲等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。1974年由Morise等從發(fā)綠色熒光的水母中提純出來。當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時，GFP能發(fā)射綠色熒光，且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，無種屬限制。1994年Chalfie等首次在大腸桿菌中表達(dá)了能發(fā)射綠色熒光的GFP，此后綠色熒光蛋白基因作為一種新

3、的報告基因受到了人們的極大關(guān)注。GFP是含238個氨基酸的多肽鏈，N端和C端都能忍受蛋白的融合，且不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，因而GFP是目前廣泛應(yīng)用的一個監(jiān)測完整細(xì)胞和組織內(nèi)基因表達(dá)及蛋白定位的理想標(biāo)記。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)比野生型GFP具有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，也更為敏感和穩(wěn)定。 為了研究RTA的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，并使這一過程可視化，在本研究中，我們重組構(gòu)建了E

4、GFP-RTA融合基因，并在大腸桿菌中順利表達(dá)，具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室研究與臨床試驗(yàn)。 [方法] 實(shí)驗(yàn)首先從重組質(zhì)粒pKK233.2-RTA中PCR擴(kuò)增出RTA序列，定向插入真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1，構(gòu)成EGFP-RTA融合基因；再PCR擴(kuò)增EGFP-RTA，插入T載體；用限制性內(nèi)切酶從T-EGFP-RTA中切下EGFP-RTA片段，定向插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-EGF

5、P-RTA。表達(dá)、純化EGFP-RTA融合蛋白。Westernblotting分析產(chǎn)物的抗原性和特異性。MTT法檢測融合蛋白的細(xì)胞毒性。將融合蛋白與真核細(xì)胞共孵育，用特異性熒光染料標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)吞后的毒蛋白在細(xì)胞中的分布。利用膠體金標(biāo)記免疫電鏡觀察內(nèi)吞后的蛋白在細(xì)胞中的分布和定位。 [結(jié)果] 通過本實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)果：1、重組質(zhì)粒pET-EGFP-RTA經(jīng)雙酶切和測序后發(fā)現(xiàn)插入的融合基因全長序列完

6、全正確，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2、質(zhì)粒pET-EGFP-RTA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，菌體產(chǎn)生綠色熒光，SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物分子量正確。 3、利用pET質(zhì)粒上6×HisTag，用金屬鎳柱進(jìn)行純化，效果較好。 4、Westernblotting分析表明融合蛋白具有良好的抗原性和特異性。 5、MTT法表明該融合蛋白呈現(xiàn)與RTA相似的細(xì)胞毒性。 6、激光掃描共聚焦顯微鏡