TERT在人卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及與體外受精-胚胎移植結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究.pdf

1、背景:
　　 自1978年世界第一例試管嬰兒誕生以來，人類輔助生殖技術(shù)(AssistedReproductiveTechnology，ART)取得了長足的進(jìn)步，為不孕癥夫婦帶來福音。但體外受精-胚胎移植（invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET）及卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射-胚胎移植(intracytoplasmicsperminjection，ICSI-ET)技術(shù)的妊娠率及活產(chǎn)率仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低

2、于人們的期望值，選擇具有高發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植是改善助孕結(jié)局的關(guān)鍵，而卵子質(zhì)量是決定胚胎“命運(yùn)”的前提。
　　 在ART中，如何選擇高質(zhì)量胚胎對于生殖醫(yī)學(xué)醫(yī)師來說仍然是具有挑戰(zhàn)意義的一項(xiàng)難題。目前，臨床上仍采用無創(chuàng)的動態(tài)形態(tài)學(xué)評分來選擇胚胎，包括原核評分、早期卵裂情況、第2天及第3天胚胎卵裂球數(shù)目及其均勻程度、核碎片比例以及第5天囊胚評分等。然而，這些主觀的形態(tài)學(xué)選擇標(biāo)準(zhǔn)并不能準(zhǔn)確客觀地反應(yīng)胚胎的發(fā)育潛能，為了彌補(bǔ)這一缺陷

3、，只有通過移植2-3個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎或1-2個(gè)囊胚才能保證著床率及臨床妊娠率，這就使多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)及母嬰孕期不良并發(fā)癥的發(fā)生率增加，同時(shí)給家庭及社會造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 卵巢顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間密切相關(guān)，前者可通過自分泌、旁分泌以及營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式影響后者的發(fā)育、成熟以及受精，甚至可影響所形成胚胎的早期發(fā)育狀態(tài)。在IVF/ICSI過程中，通過研究卵巢顆粒細(xì)胞，可以為胚胎選擇提供更加客觀、準(zhǔn)確且無創(chuàng)的方法，從而提高妊娠率

4、，推動選擇性單胚胎/囊胚移植的發(fā)展，減少高序多胎妊娠的發(fā)生及其所帶來的不良妊娠結(jié)局。
　　 卵巢發(fā)揮其生殖功能（產(chǎn)生卵子）和內(nèi)分泌功能的關(guān)鍵在于卵巢內(nèi)體細(xì)胞的增殖。既往研究表明，卵巢顆粒細(xì)胞的增殖狀態(tài)與卵子質(zhì)量息息相關(guān)。卵子發(fā)生伴隨著顆粒細(xì)胞的大量增殖，并在時(shí)間和空間上受到調(diào)控。決定細(xì)胞增殖能力的主要基因?qū)W機(jī)制之一在于端粒(telomere)長度的維持，端粒酶催化亞基(telomerasecatalyticsubunit)或端粒

5、酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)是催化端粒DNA延長的主要限速酶。TERT僅在具有高度增殖能力的組織和細(xì)胞中表達(dá)，例如骨髓造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、表皮等。目前雖已有關(guān)于人卵巢顆粒細(xì)胞端粒酶活性及端粒長度與IVF助孕結(jié)局關(guān)系的研究，但并未從mRNA水平分析卵巢顆粒細(xì)胞TERT的表達(dá)與體外受精-胚胎移植結(jié)局之間的關(guān)系。
　　 目的:
　　 本研究通過免

6、疫細(xì)胞化學(xué)法及細(xì)胞免疫熒光染色法確定卵巢顆粒細(xì)胞中TERT蛋白的定位表達(dá)，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitativerealtimePCR，qRT-PCR)技術(shù)定量分析壁層顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中TERTmRNA表達(dá)水平與體外受精-胚胎移植結(jié)局之間的關(guān)系，為卵子質(zhì)量評估及優(yōu)質(zhì)胚胎選擇提供客觀定量的依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.收集自2012年10月-2013年4月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI

7、-ET治療的不孕癥患者的卵泡液，共80例;收集行ICSI-ET治療的不孕癥患者的卵丘顆粒細(xì)胞，共26例。均為輸卵管因素或男方因素不孕癥患者。
　　 2.將收集的所有卵泡液用Ficoll密度梯度離心法分離提純卵巢壁層顆粒細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液裂解其中存在的紅細(xì)胞以減少實(shí)驗(yàn)干擾，得到的壁層顆粒細(xì)胞分為3個(gè)部分:一部分用于短期體外培養(yǎng)后細(xì)胞免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡拍照;一部分壁層顆粒細(xì)胞直接凍存于-80℃，等待后續(xù)總RNA提取、反

8、轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR測定TERTmRNA定量表達(dá);另一部分細(xì)胞短期培養(yǎng)后用4％甲醛固定并凍存于-80℃，待后續(xù)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測。
　　 3.采用SPSS12.0分析軟件對進(jìn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.TERT在壁層顆粒細(xì)胞胞漿及胞核中表達(dá)，卵丘細(xì)胞中亦表達(dá)TERTmRNA。
　　 2.在壁層顆粒細(xì)胞中，低齡組TERT蛋

9、白及mRNA表達(dá)水平均顯著高于高齡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(145.13±28.63vs.123.82±24.34，P＜0.05;1.27(1.00，2.28)vs.0.51(0.23,0.97),P＜0.05)。
　　 3.壁層顆粒細(xì)胞低齡組中，妊娠組較非妊娠組TERT蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（155.73±29.36vs.132.06±22.37，P＜0.05）。
　　 4.在壁層顆粒細(xì)胞中，TERT蛋白及

10、mRNA表達(dá)水平均與患者年齡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.401,P＜0.05;r=-0.386,P＜0.05）。
　　 5.在卵丘細(xì)胞中，低齡組TERTmRNA表達(dá)水平顯著高于高齡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.45(0.18,0.83)vs.0.13(0.03,0.34),P＜0.05)。
　　 6.卵丘細(xì)胞低齡組和高齡組中，妊娠組TERTmRNA相對表達(dá)水平較非妊娠組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.77(0.44，1.00)

11、vs.0.21(0.12，0.47),P＜0.05;0.22(0.09,0.40)vs.0.017(0.005,0.028),P＜0.05)。
　　 7.卵丘細(xì)胞中TERTmRNA表達(dá)水平與年齡呈負(fù)相關(guān)（r=-0.654，P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.TERT蛋白及mRNA在MGCs中表達(dá)，與年齡呈負(fù)相關(guān)，前者可在一定程度上預(yù)測妊娠。
　　 2.CCs中TERTmRNA表達(dá)與年齡呈負(fù)相關(guān)，可預(yù)