自噬在糖基化終末產物抑制破骨細胞形成和功能中的作用.pdf

1、目的:糖尿病性骨質疏松嚴重影響人們的健康和生活，糖尿病或高血糖狀態(tài)與糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)的形成密切相關，而不同濃度的AGEs對成骨細胞和破骨細胞的作用不盡相同，并且可導致骨強度降低、骨脆性增加以及骨質疏松。但是，明確AGEs對破骨細胞形成和功能的影響以及明確自噬在AGEs影響破骨細胞形成和功能中的作用對于糖尿病性骨質疏松的治療有一定的意義。
　　方法:以RAW2

2、64.7細胞作為破骨細胞的前體細胞，在鋪板后第二天加入RANKL(receptor activator for nuclear factor-B ligand)和M-CSF(macrophagecolony-stimulating factor)等誘導破骨細胞產生。觀察和檢測不同濃度AGEs作用下破骨細胞的形成和功能，并用氯喹和雷帕霉素分別抑制和激活自噬后，觀察破骨細胞的形成和功能。1、通過CCK-8（Cell Counting Kit

3、-8）試劑盒檢測不同AGEs濃度下RAW264.7細胞的細胞活力;2、通過TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase)染色鑒定破骨細胞的形成，并檢測不同AGEs濃度以及自噬對破骨細胞形成的影響;3、通過western blot檢測不同AGEs濃度下LC3、p62以及Cathepsin K等蛋白的表達差異;4、通過LC3免疫熒光染色鑒定細胞內的自噬強度，MDC(Monodansylcadaverine

4、)免疫熒光試驗作為一個輔助試驗用以檢測細胞內自噬泡的形成;5、通過利用Osteo Assay Surface檢測不同干預因素下的骨吸收差異。
　　結果:1、未發(fā)現0mg/l（對照組），50 mg/l，100 mg/l，150 mg/l，200 mg/l的AGEs以及100mg/l的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)對RAW264.7細胞有毒性作用;2、0mg/l-200mg/l的AGEs濃度內，隨著A

5、GEs濃度的升高，Cathepsin K的表達量降低，100mg/l的AGEs與對照組相比，TRAP染色后破骨細胞的形成數量減少，骨吸收面積減少;3、在氯喹的作用下，TRAP染色后破骨細胞的形成較對照組減少且骨吸收面積減少，而在雷帕霉素的作用下，TRAP染色后破骨細胞的形成較對照組增加且骨吸收面積增加;4、0mg/l-200mg/l的AGEs濃度下，隨著AGEs濃度的升高，LC3Ⅱ/β-actin數值降低而p62/β-actin數值增加