自噬在糖皮質(zhì)激素調(diào)控成骨細胞功能中的作用和機制.pdf

1、目的：通過從細胞自噬角度探討糖皮質(zhì)激素對成骨細胞的調(diào)控，即糖皮質(zhì)激素是否引起成骨細胞自噬，自噬流的強弱是否與糖皮質(zhì)激素劑量及作用時間有關(guān)，以及人為干預(yù)自噬是否對當皮質(zhì)激素作用下的成骨細胞功能產(chǎn)生影響，進一步拓展了激素相關(guān)骨質(zhì)疏松的病理機制，對闡明自噬是否參與了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松(GIOP)，以及為發(fā)現(xiàn)抗骨質(zhì)流失藥物新靶點提供了重要參考價值。
　　方法：首先將培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1等量接種于六孔板中，待培養(yǎng)一段

2、時間后，分別加入含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)基(10-8M，10-6M，10-4M)，分別在1d，2d，3d，4d時間點收集細胞。①通過Western blot技術(shù)檢測成骨細胞內(nèi)源性自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin1的表達量，探討地塞米松是否誘導(dǎo)了細胞自噬以及自噬水平是否與激素劑量和作用時間有關(guān)。②使用能表達綠色熒光蛋白GFP的LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，然后再與含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)液共同作用，通過熒光共聚焦顯微鏡檢測細胞質(zhì)內(nèi)是否有特征性

3、的GFP-LC3B聚集，即直視下觀察是否有自噬小體的形成以及自噬小體陽性細胞的數(shù)量。③應(yīng)用流式細胞儀檢測地塞米松作用下成骨細胞的凋亡情況，以及人工干預(yù)自噬是否可以調(diào)控成骨細胞凋亡。④最后，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測地塞米松作用下，功能基因的表達情況，以及加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA后，成骨細胞功能基因表達是否發(fā)生變化。
　　結(jié)果：1.蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測顯示地塞米松誘導(dǎo)下，MC3T3-E1

4、細胞中有LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白的表達;熒光共聚焦顯微鏡顯示細胞質(zhì)內(nèi)有GFP-LC3B斑點產(chǎn)生。
　　2.隨著培養(yǎng)液中地塞米松濃度的升高，Western blot檢測成骨細胞內(nèi)源性自噬相關(guān)蛋白LC3B及Beclin1表達均呈上升趨勢。熒光共聚焦顯微鏡檢測eGFP-LC3B標記的自噬小體。培養(yǎng)液中藥物濃度上升時，eGFP-LC3B斑點數(shù)量上升、更加濃聚，eGFP-LC3B陽性細胞數(shù)量增多。
　　3.隨著Dex作用時間延長

5、，細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B及Beclin1的表達在48小時達到峰值，隨后下降。鏡下觀察eGFP-LC3B陽性細胞數(shù)量以及熒光斑點形成情況也與Western blot檢測蛋白表達情況相符。
　　4.隨著地塞米松濃度升高，MC3T3-E1細胞凋亡率增加;加入自噬抑制劑3-MA后，細胞凋亡率上升。
　　5.隨著地塞米松濃度升高，MC3T3-E1細胞Alp、Colla1、Ocn基因的表達量下降。加入自噬抑制劑3-MA后，基因表達量

6、進一步降低，加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素后，基因表達量下降不明顯。
　　結(jié)論:1.糖皮質(zhì)激素GCs可以誘導(dǎo)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1的自噬發(fā)生
　　2.細胞中自噬水平與地塞米松作用濃度呈正相關(guān);自噬水平在地塞米松作用48h達到峰值，而后隨著時間延長而下降
　　3.地塞米松誘導(dǎo)小鼠成骨細胞的凋亡，且濃度增加凋亡率增高。抑制自噬可以促進細胞的凋亡。
　　4.地塞米松抑制小鼠成骨細胞基因的表達，抑制作用隨濃度增加而增加。