TRB3在糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞氧化損傷和凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、2型糖尿病的發(fā)病過程中許多細(xì)胞外環(huán)境因素如高血糖，高游離脂肪酸，炎癥性細(xì)胞因子，淀粉樣物質(zhì)等均可導(dǎo)致的β細(xì)胞損傷并發(fā)生凋亡。最近研究表明在糖尿病的發(fā)病過程中，糖基化終末產(chǎn)物（Advancedglycationend products, AGEs）通過糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)也能夠?qū)Ζ录?xì)胞造成損傷，可能是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰竭和數(shù)量減少的因素之

2、一。機(jī)體內(nèi)血糖水平升高時(shí)AGEs生成反應(yīng)加速在體內(nèi)積累，并對(duì)組織和細(xì)胞造成損傷效應(yīng)。但目前AGEs導(dǎo)致β細(xì)胞損傷的具體分子機(jī)制還不十分清楚。
　　Tribbles同源蛋白3（Tribbles homolog3，TRB3）是一種不具有激酶活性，但是可以作為腳手架蛋白樣調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)節(jié)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能。TRB3在胰島素靶組織表達(dá)，通過干擾胰島素通路參與了外周胰島素抵抗的發(fā)生。此外，TRB3

3、可以被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡中重要的介導(dǎo)因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)誘導(dǎo)表達(dá)，并參與促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是其促凋亡作用存在爭(zhēng)議。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，TRB3在胰島β細(xì)胞凋亡中起到重要作用。在高糖、高脂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均通過上調(diào)TRB3介導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。是否TRB3也參與了AGEs引起的胰島β細(xì)胞損傷值得研究。
　　研究目的：
　　通過檢測(cè)糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)AGEs水平和胰島細(xì)胞中TRB

4、3的表達(dá)情況，以及體外AGEs刺激條件下胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞中TRB3的表達(dá)情況，并通過基因過表達(dá)或干擾，研究TRB3對(duì)AGEs誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響，探討TRB3在AGEs誘導(dǎo)β細(xì)胞氧化損傷和凋亡中的作用及機(jī)制。
　　研究方法：
　　分析TRB3與AGEs水平及細(xì)胞凋亡的關(guān)系:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):采集糖尿病發(fā)病不同階段（第0月、3月、6月和9月）的GK大鼠血清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme

5、linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)血清中AGEs水平;分離純化GK大鼠胰島，應(yīng)用Caspase-Glo3/7凋亡酶活性檢測(cè)試劑盒評(píng)估胰島細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)GK大鼠胰島細(xì)胞RAGE和TRB3表達(dá)水平，以初步判斷TRB3表達(dá)與AGEs水平及胰島細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。
　　體外實(shí)驗(yàn):采用200 ug/mlAGEs刺激INS-1細(xì)胞48 h后，應(yīng)用C

6、CK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，應(yīng)用TUNEL染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinⅤ-FITC/PI觀察AGEs對(duì) INS-1細(xì)胞凋亡的影響;應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中RAGE、TRB3的表達(dá)水平。
　　分析TRB3介導(dǎo)AGEs對(duì)INS-1細(xì)胞損傷作用的機(jī)制:
　　應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)AGEs處理后INS-1中RAGE、TRB3和NADPH氧化酶4(ni

7、cotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4，NOX4)的表達(dá)水平;應(yīng)用活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)試劑盒評(píng)估細(xì)胞中ROS水平。
　　采用tet-on系統(tǒng)建立可誘導(dǎo)TRB3過表達(dá)的INS-1細(xì)胞，采用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾法建立TRB3穩(wěn)定敲降的INS-1細(xì)胞。檢測(cè)TRB3過表達(dá)或敲降對(duì)細(xì)胞凋亡、NOX4 mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)水

8、平及細(xì)胞中ROS水平的影響。
　　分析TRB3對(duì)PKC信號(hào)通路的影響:
　　采用AGEs刺激INS-1細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot檢測(cè)TRB3敲降對(duì)AKT的磷酸化水平、PKCδ的核轉(zhuǎn)位及PKCβ2膜轉(zhuǎn)位的影響。采用PKCβ2抑制劑LY333531處理INS-1細(xì)胞后，評(píng)估抑制PKCβ2活性對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞中NOX4的表達(dá)和ROS水平的影響。
　　研究結(jié)果：
　　糖尿病GK大鼠血清AGEs的水平隨著糖尿病病

9、程的延長(zhǎng)而進(jìn)行性升高，發(fā)病6個(gè)月后明顯高于Wistar大鼠。此時(shí)，GK大鼠胰島細(xì)胞中Caspase3/7凋亡酶活性增強(qiáng)，RAGE和TRB3的表達(dá)水平增高。
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，200 ug/ml的AGEs處理INS-1細(xì)胞48h后細(xì)胞的存活率為明顯低于對(duì)照組。同時(shí)細(xì)胞凋亡水平增高，TUNEL染色陽性細(xì)胞在AGEs組明顯高于對(duì)照組，AnnexinⅤ-FITC/PI的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也同時(shí)顯示AGEs組凋亡率為明顯高于對(duì)照組。細(xì)

10、胞內(nèi)RAGE、TRB3和NOX4的表達(dá)水平升高;細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加。
　　TRB3過表達(dá)后，AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平均增高。敲降TRB3的表達(dá)之后，AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞內(nèi)NOX4的表達(dá)及ROS的水平明顯降低。
　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著TRB3的表達(dá)上調(diào)PKCβ2表達(dá)水平增高，同時(shí)，膜轉(zhuǎn)位增加;敲降TRB3后PKCβ2表達(dá)水平下降和膜轉(zhuǎn)位減少。而給予PKCβ2特異性抑制劑也能夠減少AGEs