兩種布魯氏菌弱毒株侵染小鼠巨噬細(xì)胞過程的熒光表征及分析.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP的整合性布魯氏菌M5和S19（以下簡(jiǎn)稱GFP-M5和GFP-S19）；比較GFP-M5和GFP-S19與正常布魯氏菌M5和S19在巨噬細(xì)胞中的存活能力，證明GFP基因的轉(zhuǎn)入不會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。分析GFP-M5和GFP-S19侵染巨噬細(xì)胞后與溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體結(jié)合產(chǎn)生陽性黃色熒光數(shù)量；分析GFP-M5和GFP-S19侵染小鼠巨噬細(xì)胞前期成功的數(shù)量；分析GFP-M5在特定時(shí)間內(nèi)的傳代培養(yǎng)過程中綠

2、色熒光基因表達(dá)的丟失情況；觀察GFP-M5感染小鼠后，脾臟切片的熒光表達(dá)情況，為布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)及小鼠體內(nèi)的生存繁殖及致病機(jī)制的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、pMC-221載體電轉(zhuǎn)化進(jìn)入布魯氏菌M5和S19的感受態(tài)細(xì)胞，檢測(cè)成功后獲得GFP-M5和GFP-S19。
　　2、將布魯氏菌M5和S19與GFP-M5和GFP-S19培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后收集菌體，用麥?zhǔn)媳葷岬姆椒?，按照?xì)菌和細(xì)胞的比例為100:1進(jìn)行侵染，

3、利用平板計(jì)數(shù)法來比較正常細(xì)菌與GFP-布魯氏菌在胞內(nèi)存活的能力。
　　3、用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP-M5和GFP-S19與巨噬細(xì)胞溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的結(jié)合，分析兩者與各細(xì)胞器結(jié)合產(chǎn)生陽性黃色熒光的數(shù)量。
　　4、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析 GFP-M5和GFP-S19侵染小鼠巨噬細(xì)胞各時(shí)期產(chǎn)生的GFP+巨噬細(xì)胞百分比。
　　5、將GFP-M5分別放置含氯霉素抗性和不含氯霉素抗性的布魯氏菌液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，將各傳

4、代時(shí)期的菌液侵染小鼠巨噬細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析，綠色熒光蛋白基因丟失的情況。
　　6、將GFP-M5和GFP-S19感染小鼠特定時(shí)間后，取出小鼠脾臟進(jìn)行拍照分析和切片熒光顯微鏡下的觀察。
　　結(jié)果：
　　1、通過對(duì)電轉(zhuǎn)后的菌株進(jìn)行PCR的鑒定，pMC-221成功轉(zhuǎn)化至兩種布魯氏菌。
　　2、通過CFU結(jié)果顯示，GFP-M5和GFP-S19對(duì)比布魯氏菌M5和S19在不同時(shí)間階段的細(xì)菌計(jì)數(shù)無明顯差異，兩種菌株

5、是否轉(zhuǎn)化有 pMC-221載體，對(duì)菌株侵染小鼠巨噬細(xì)胞的侵染能力沒有影響。
　　3、通過GFP-M5和GFP-S19對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的侵染，1h、2h、3h、4h爬片結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡下的觀察可以得出，兩種菌株與小鼠巨噬細(xì)胞各細(xì)胞器結(jié)合能力并無顯著差異，說明兩者的侵染能力相當(dāng)，4h以內(nèi)在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制、繁殖等能力相當(dāng)。
　　4、通過GFP-M5和GFP-S19侵染小鼠巨噬細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果可以得知，30min時(shí)，兩種菌

6、株都已經(jīng)進(jìn)入巨噬細(xì)胞，在30min至6h的侵染過程中，兩種菌株對(duì)巨噬細(xì)胞的侵染能力沒有顯著的差異，說明兩種菌株在前6h的侵染能力與在巨噬細(xì)胞中的繁殖能力相當(dāng)。
　　5、通過熒光倒置顯微鏡的觀察與分析，可以得知布魯氏菌 M5在侵染小鼠巨噬細(xì)胞后不會(huì)表達(dá)綠色熒光蛋白，而轉(zhuǎn)化子GFP-M5菌株在侵染小鼠巨噬細(xì)胞后可以成功表達(dá)綠色熒光蛋白，說明GFP基因表達(dá)成功。通過各個(gè)時(shí)間段的GFP-M5對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞侵染，流式細(xì)胞儀對(duì) GFP+巨噬細(xì)

7、胞百分比測(cè)定得知，培養(yǎng)基中是否含有氯素抗性，這個(gè)因素不會(huì)影響GFP-M5綠色熒光蛋白基因的丟失，從而又可以看出，GFP-M5菌株傳代培養(yǎng)過程中，綠色熒光蛋白都沒有丟失表達(dá)的現(xiàn)象，說明在此時(shí)間段內(nèi)，GFP-M5菌株的熒光表達(dá)和對(duì)其的觀察不會(huì)受到影響，也奠定了 GFP-布魯氏菌感染小鼠機(jī)體，通過小鼠機(jī)體對(duì)GFP-布魯氏菌直接觀察與試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　6、從小鼠脾臟的解剖觀察可以看出，感染過GFP-M5的小鼠較健康的小鼠脾臟顏色

8、較深。通過感染后的小鼠脾臟切片的觀察可以看出，GFP-M5和GFP-S19感染后的小鼠脾臟中，都可以觀察到表達(dá)了綠色熒光蛋白的布魯氏菌，說明布魯氏菌已經(jīng)侵染進(jìn)入到了脾臟中的巨噬細(xì)胞內(nèi)。
　　結(jié)論：
　　本試驗(yàn)結(jié)果表明布魯氏菌M5和S19在小鼠巨噬細(xì)胞前期的復(fù)制、繁殖等能力相當(dāng)；在30天傳代的時(shí)間中，GFP基因片段的表達(dá)并沒有丟失的現(xiàn)象，這為表達(dá)綠色熒光的布魯氏菌侵染活體動(dòng)物的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；布魯氏菌感染小鼠一周后，在熒光