抗菌肽天蠶素A截短肽的高效表達、分離純化及抗體制備.pdf

1、背景介紹: 近年來由于抗生素的大量使用，導致臨床耐藥株日益增多，故尋找新種類抗菌藥成為當前的研究熱點。自從瑞典科學家Boman在惜古比天蠶（Hyalophoracecropia）中發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來，已有幾百種抗菌肽被相繼發(fā)現(xiàn)。抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定、水溶性好、免疫原性較低、作用迅速的特點，不僅可以有效殺滅細菌、真菌、病毒和寄生蟲，部分還有一定抗惡性腫瘤作用，并且不易產生耐藥性，對真核細胞毒性作用低等特點，備受關注。其相應的原核

2、、真核、昆蟲等表達體系也被構建。但由于其本身的抗菌活性，使其很難在原核細胞的工程菌中表達，而真核等系統(tǒng)的表達量卻難以達到要求。與傳統(tǒng)抗生素相比某些抗菌肽的抗菌活性還不夠理想，改造已有抗菌肽和設計新抗菌肽分子是提高活性的有效途徑。這就需要進一步研究抗菌肽結構與活性的關系，為抗菌肽分子的改造和設計提供足夠的理論依據(jù)。與抗菌肽相關的某些毒性作用、在動物機體內的穩(wěn)定性等問題有待研究。但隨著抗菌肽及轉基因技術在理論和應用上更深入的研究，抗菌肽最終

3、必將對人類醫(yī)學產生深遠影響。 目的: 通過將天蠶素A（cecropin A，CA）截短肽的串連融合表達，降低其對工程菌的毒性和提高其表達產量，為其產業(yè)化提供可能的方法。比較CA其兩個α螺旋區(qū)域的活性是否一樣，兩個α螺旋和一個α螺旋的抑菌活性是否有區(qū)別，從而為改造已有抗菌肽和設計新抗菌肽分子提高活性的途徑，提供理論依據(jù)。通過了解CA的抗原性區(qū)域，制備高質量抗體，為以后更好的檢測抗菌肽CA在異源表達系統(tǒng)中的表達情況及表達產量

4、提供幫助。 方法: 1.使用蛋白質專家分析系統(tǒng)（ExPASy，http：//www.expasy.org/）的PredictProtein程序分析CA序列的二級結構，PROSITE SCAN程序分析其功能位點。根據(jù)二級結構和功能位點分析，選取氨基酸區(qū)域1～19作為CA19，18～36作為CA36，2～10和25～32通過GP連接作為CA210。 2.根據(jù)密碼子的偏愛性設計合成3對反向互補的核苷酸單鏈，并在每條單鏈

5、的3’端加上ATG尾。將3對核苷酸單鏈分別磷酸化后退火延伸。用連接酶將這3對核苷酸雙鏈串連為不同拷貝數(shù)的串連體后構建于pET-31b（+）載體，轉入大腸桿菌DH5α進行克隆，隨機挑選菌落經PCR后用瓊脂糖鑒定。 3.將鑒定陽性質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）上進行串連融合表達，并優(yōu)化誘導表達條件。選擇優(yōu)化后的誘導條件進行誘導表達，用SDS-PAGE分析，Western-blot鑒定。 4.表達產物用親和層析將其純化后，

6、融合蛋白用CNBr切割成單體，通過復性、冷凍干燥濃縮等步驟，分離、純化和濃縮抗菌肽，用Tricine SDS-PAGE鑒定抗菌肽的純度和性質。 5.用大腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢測其抗菌活性。用微量稀釋法檢測其最小抑菌濃度。 6.將部分純化的融合蛋白免疫BLAB/C小鼠，分別在第三、四次免疫一周后斷尾取血，ELISA檢測其效價。Western-blot鑒定其特異性。 結果:

7、 1.將CA19、CA36、CA210的互補DNA雙鏈經DNA連接酶作用后，成功構建了1～5個拷貝的串連體。瓊脂糖電泳分析分別在其相應分子量的位置有特異性條帶。轉化入大腸桿菌DH5α的pET-31b（+）-CA19（CA36、CA210）1～5質粒經菌落PCR鑒定、瓊脂糖電泳分析正確后測序，其插入位置和序列完全正確，成功構建了CA各截短肽的串連融合表達載體。 2.融合蛋白CA19（CA36、CA210）1～5，在37℃、I

8、PTG濃度為0.2mmol、誘導時機為第2h加入、誘導3h后得到穩(wěn)定的表達量，其中CA19-3、CA36-3和CA210-3的表達量最高，分別為37.5％、39.1％和38.8％。融合蛋白經SDS-PAGE分析，證實其大小一致，Western-blot鑒定有特異性條帶。 3.親和層析純化后的重組蛋白用BandScan5.0分析其純度均達90％以上。經CNBr切割獲得單體，用Tricine SDS-PAGE鑒定在2kD處可見一條特

9、異的目的條帶。 4.抑菌實驗顯示CA各截短肽對各革蘭氏陰性菌的抑菌能力強于革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌，抑菌活性從大到小為CA210>CA19>CA36。此外，通過微量稀釋法得出各CA截短肽的最小抑菌濃度為16μg/ml～128μg/ml。 5.免疫的小鼠抗血清經ELISA檢測，CA19、CA36、CA210第三次免疫后的效價，分別為1：2000、1：1000、1：1000，加強免疫后的效價分別為1：10000、1：500

10、0、1：5000；抗血清用Western-blot鑒定可見特異性條帶。而空載的誘導蛋白抗血清ELISA和Western-blot檢測結果均為陰性。 結論: 1.成功構建了基于序列分析的天蠶素A各截短肽串連融合表達載體，為其不易被原核細胞工程菌表達和表達量低的問題，提供了可能的解決途徑。 2.通過對天蠶素的序列分析，采用了其兩個α螺旋區(qū)分別表達和聯(lián)合表達，其中含兩個α螺旋的CA210的抑菌活性最強，而含N端α螺旋的