六處天蠶素類基因工程抗菌肽的研制及應用.pdf

1、抗生素的濫用不僅導致了藥物殘留等公共衛(wèi)生隱疾，而且由于耐藥菌株的出現(xiàn)，使得細菌性疾病的防治再次成為困擾人類的難題。一種全新抗菌藥物的開發(fā)已經(jīng)成為當代微生物學家、醫(yī)藥學家和獸醫(yī)工作者的主攻課題。抗菌肽由于其廣譜高效抗菌活性及獨特的抗菌機制而在新型抗菌藥物研究中顯露明顯優(yōu)勢。
　　 抗菌肽（Antibacterial peptides，ABP）是生物體產(chǎn)生的一種陽離子小肽，多數(shù)具有廣譜抗菌活性，是生物先天性免疫的重要組成成份。僅作用

2、于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞。近20年來，人們對昆蟲抗菌肽已進行了比較系統(tǒng)的理論和應用研究。但有關(guān)畜禽抗菌肽基因工程應用研究方面的報道較少。本研究的目的就是應用基因工程研制出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的六種天蠶素類重組基因工程抗菌肽，以及作為一種添加劑對雞腸道正常微生物菌群的影響。為重組抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。研究主要從以下幾個方面展開：
　　 1.選用畢赤酵母偏愛密碼子，通過SOE法合成抗菌肽Cecropin B基因，并在其N端引

3、入Kex2酶切位點。亞克隆Cecropin B并將3個亞克隆串聯(lián)在一起，每個單體前都加上Kex2酶切位點，將cecropin B及其串聯(lián)體克隆至表達載體pPICZα-A上，用SacⅠ酶切使之線性化后，采用電擊法轉(zhuǎn)化酵母SMD1168，轉(zhuǎn)化子用小瓶發(fā)酵。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測，在α信號因子的引導下，表達產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)基中，初步抑菌活性試驗顯示，二者對金黃色葡萄球菌和耐氨芐青霉素的大腸桿菌有較好的抑殺活性。從抑菌直徑來看

4、，串聯(lián)體并不像預計的那樣比單體的抑菌直徑大3倍，單從表達量方面分析不足以說明3個單體都得到了表達，這可能與畢赤酵母的表達條件有關(guān)，也可能與Kex2酶切位點的酶切效果有關(guān)。其具體原因還有待于進一步的研究和探討。
　　 2.根據(jù)抗菌肽天蠶素A（cecropinA，CA）N端第1-7個氨基酸殘基，馬蓋寧（magainin，M）N端第2-12個氧基酸殘基，以畢赤酵母偏愛的密碼子設(shè)計合成了雜合肽CA（1-7）-M（2-12）基因，同載體p

5、PICZα-A連接后轉(zhuǎn)化。Pichia pastoris受體菌SMD1168，在醇氧化酶（AOX）啟動子調(diào)控下，分子量約1.9kD的CecA-Mag雜合抗菌肽獲得表達，抗菌特性研究表明，該表達產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性，對多數(shù)G-菌及G+菌均有較好的抑菌活性。在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)天蠶素類抗菌肽的作用機制以及抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的假說，設(shè)計了雜合肽cecA-mag的三個突變體并利用重組聚合酶鏈式反應定點誘變技術(shù)，使突變體得以合成，利

6、用瓊脂孔擴散法檢測cecA-mag和其突變體對金黃色葡萄球菌的抑菌效價.試驗結(jié)果顯示，三個突變體的抑菌活性比cecA-mag分別提高了1.2、1.2、1.5倍。
　　 3.畢赤酵母SMD1168菌株由于蛋白酶A和羧肽酶Y活性全部缺失，僅存部分蛋白酶B活性，該特性非常有利于發(fā)酵液中重組抗菌肽表達物的穩(wěn)定，較之X-33、GS115兩種酵母菌株，更適合表達抗菌肽之類的生物活性小肽，本實驗選用SMD1168畢赤酵母菌株表達Cecropi

7、nB以及其串聯(lián)體基因和cecA-mag的三個突變體基因抗菌肽.對上述六種重組酵母菌的搖瓶發(fā)酵條件進行了表達優(yōu)化，結(jié)果表明重組酵母菌在BMGY培養(yǎng)基中增殖OD600為5～6時轉(zhuǎn)接BMMY培養(yǎng)基；BMMY培養(yǎng)基pH值為6.0，28℃培養(yǎng)60 h；補加1.0％甲醇；可提高重組抗菌肽的表達量和抗菌活性。抑菌試驗，證明重組基因工程抗菌肽對G+和G-均具有良好的活性.酸堿穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，所表達的重組抗菌肽在pH等于3.5時仍然有很好的活性，熱穩(wěn)

8、定性實驗顯示，重組抗菌肽100℃加熱5 min，仍有活性，基于這樣的特性該抗菌肽有望在飼料和食品添加劑中得到很好的應用。重組抗菌肽的體外穩(wěn)定性試驗顯示，所研制成功的六種基因工程抗菌肽在4℃到保存30天仍有良好的活性，從而提示4℃是其最佳的保存方式。目前為止，還沒有對抗菌肽的單位有權(quán)威的最后報道，表達量的高低也不能簡單的等同為活性的強弱，所以筆者認為濃度單位可能是恰當?shù)挠脕砗饬科浠钚缘姆绞?，所以對研制成功的六種基因工程抗菌肽單位應用MIC

9、來初步表示.大腸桿菌的MIC的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：cecA-mag、cecA-mag-mu-1、cock-mag-mu-2，cecA-mag-mu-3、cccB、3×cecB對大腸桿菌的MIC分別為：0.92、0.73、0.75、0.69、0.5、0.41μM。在此基礎(chǔ)上對合成的六種基因工程抗菌肽的抗菌譜進行了完善。對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用通過其生長曲線有了系統(tǒng)的了解，通過曲線顯示對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在cecB和cecA-m

10、ag在40μg mL-1的使用劑量下上述兩種細菌得到完全抑制!
　　 4.以普通1日齡萊杭蛋雛雞為研究對象，將120只雛雞分為6個組，每組20只，其中不同劑量抗菌肽治療組又分為口服和肌肉注射兩個不同的處理，每個處理10只。研究了重組抗菌肽CecropinB治療雛雞大腸桿菌感染的效果。通過預試驗，初步確定了選用的大腸桿菌對雛雞的最小致死劑量（MLD100）為1×107個細菌。最小致死劑量（1×107個細菌/mL）大腸桿菌肌肉注射2

11、4h后，肌肉注射和口服不同濃度的重組cecropinB抗菌肽，連續(xù)治療5天。結(jié)果表明，重組抗菌肽CecropinB對大腸桿菌有較好的治療效果。其中高劑量（0.75mL）的口服組的效果最佳，其治療效果要優(yōu)于市面上出售的獸用鹽酸環(huán)丙沙星效果，治愈率達到80％，中劑量（0.5mL）的口服組與高劑量肌肉注射組的治愈率相同為70％。中劑量肌肉注射組與環(huán)丙沙星組效果一致，治愈率達到60％，低劑量抗菌肽治療組，治療效果不如上述的所有治療組，說明所研制

12、的基因工程抗菌肽在治療大腸桿菌感染時存在一定的劑量依賴關(guān)系。與感染對照組相比，所有組別的雛雞死亡率顯著降低，抗菌肽高、中、低劑量組的有效率、治愈率與環(huán)丙沙星組差異不顯著。
　　 5.抗菌肽作為生物體先天性免疫的主要組成成份，在抵御外來病原侵襲中發(fā)揮著重要作用，特別是兩棲類和昆蟲類，缺乏高效精確的細胞免疫系統(tǒng)，所以抗菌肽就成了其免疫防御系統(tǒng)的關(guān)鍵成份?？咕膶毦?、真菌、病毒、原蟲及癌變細胞都具有廣泛的殺傷活性。將250羽健康蛋雛

13、雞隨機分成5組，每組50羽，其中鹽酸環(huán)丙沙星組為抗生素對照組，空白對照組不添加任何成份，合成的基因工程抗菌肽cecropinB高、中、低三個劑量以飲水混飲的方式飼喂，高中低劑量分別為2、4、8ml L-1對實驗各組雞的免疫器官指標以及體重增重進行了測試和分析，結(jié)果表明，所選用的抗菌肽高中低劑量組都不同程度的增強了雞的平均日增重，不同劑量之間差異顯著（P<0.01），對雛雞免疫功能的增強作用通過脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)三個指標得以體

14、現(xiàn)，以高劑量組的增強作用最為明顯。此外，對基因工程抗菌肽CecropinB對雞巨噬細胞的吞噬能力進行了探討。SPSS統(tǒng)計結(jié)果表明，高劑量組吞噬率與其它各組比較，差異顯著（P>0.05）；高劑量組吞噬指數(shù)與藥物對照組比較，差異顯著（P>0.05），總體看來，實驗組的吞噬率和吞噬指數(shù)高于對照組，尤其是高劑量組吞噬率和吞噬指數(shù)明顯高于對照組，吞噬率和吞噬指數(shù)是巨噬細胞吞噬功能的具體表現(xiàn)，從而說明基因工程抗菌肽CecropinB可以提高雞巨噬細

15、胞的吞噬能力。這一研究結(jié)果為基因工程抗菌肽的進一步應用奠定了基礎(chǔ)。
　　 6.動物腸道內(nèi)棲息著復雜多樣的微生物區(qū)系，該區(qū)系對宿主的生長、健康具有重要意義.為研究CecropinB對雛雞腸道微生物區(qū)系的影響，試驗將250只1日齡雛雞隨機分成五個處理組，每個處理組50只，試驗組以混飲的方式飼喂不同濃度的CecropinB，對照組也以混飲的方式飼喂鹽酸環(huán)丙沙星，空白對照組飲水中不添加任何成份。用量和飼喂方法同上。分別于42、49d取盲

16、腸、回腸內(nèi)容物進行PCR-DGGE，對腸道的幾種優(yōu)勢菌的多樣性進行了研究.分析結(jié)果表明，飼喂含CecropinB對雛雞盲腸、回腸中微生物種群種類未產(chǎn)生明顯的影響，各組雞腸道中微生物種群類型既具有一定的相似性，又存在一定的差異.對回腸內(nèi)容物16SrDNA進行克隆、測序顯示，飼喂CecropinB的高劑量組比空白對照組多了一條與厭氣彎桿菌同源性為78％的條帶，其具體原因和機理還有待于進一步的研究。試驗結(jié)果顯示，CecropinB作為一種飼料