六處天蠶素類(lèi)基因工程抗菌肽的研制及應(yīng)用.pdf

1、抗生素的濫用不僅導(dǎo)致了藥物殘留等公共衛(wèi)生隱疾，而且由于耐藥菌株的出現(xiàn)，使得細(xì)菌性疾病的防治再次成為困擾人類(lèi)的難題。一種全新抗菌藥物的開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為當(dāng)代微生物學(xué)家、醫(yī)藥學(xué)家和獸醫(yī)工作者的主攻課題?？咕挠捎谄鋸V譜高效抗菌活性及獨(dú)特的抗菌機(jī)制而在新型抗菌藥物研究中顯露明顯優(yōu)勢(shì)。
　　 抗菌肽（Antibacterial peptides，ABP）是生物體產(chǎn)生的一種陽(yáng)離子小肽，多數(shù)具有廣譜抗菌活性，是生物先天性免疫的重要組成成份。僅作用

2、于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞。近20年來(lái)，人們對(duì)昆蟲(chóng)抗菌肽已進(jìn)行了比較系統(tǒng)的理論和應(yīng)用研究。但有關(guān)畜禽抗菌肽基因工程應(yīng)用研究方面的報(bào)道較少。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的六種天蠶素類(lèi)重組基因工程抗菌肽，以及作為一種添加劑對(duì)雞腸道正常微生物菌群的影響。為重組抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。研究主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：
　　 1.選用畢赤酵母偏愛(ài)密碼子，通過(guò)SOE法合成抗菌肽Cecropin B基因，并在其N(xiāo)端引

3、入Kex2酶切位點(diǎn)。亞克隆Cecropin B并將3個(gè)亞克隆串聯(lián)在一起，每個(gè)單體前都加上Kex2酶切位點(diǎn)，將cecropin B及其串聯(lián)體克隆至表達(dá)載體pPICZα-A上，用SacⅠ酶切使之線(xiàn)性化后，采用電擊法轉(zhuǎn)化酵母SMD1168，轉(zhuǎn)化子用小瓶發(fā)酵。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)，在α信號(hào)因子的引導(dǎo)下，表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)基中，初步抑菌活性試驗(yàn)顯示，二者對(duì)金黃色葡萄球菌和耐氨芐青霉素的大腸桿菌有較好的抑殺活性。從抑菌直徑來(lái)看

4、，串聯(lián)體并不像預(yù)計(jì)的那樣比單體的抑菌直徑大3倍，單從表達(dá)量方面分析不足以說(shuō)明3個(gè)單體都得到了表達(dá)，這可能與畢赤酵母的表達(dá)條件有關(guān)，也可能與Kex2酶切位點(diǎn)的酶切效果有關(guān)。其具體原因還有待于進(jìn)一步的研究和探討。
　　 2.根據(jù)抗菌肽天蠶素A（cecropinA，CA）N端第1-7個(gè)氨基酸殘基，馬蓋寧（magainin，M）N端第2-12個(gè)氧基酸殘基，以畢赤酵母偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)合成了雜合肽CA（1-7）-M（2-12）基因，同載體p

5、PICZα-A連接后轉(zhuǎn)化。Pichia pastoris受體菌SMD1168，在醇氧化酶（AOX）啟動(dòng)子調(diào)控下，分子量約1.9kD的CecA-Mag雜合抗菌肽獲得表達(dá)，抗菌特性研究表明，該表達(dá)產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性，對(duì)多數(shù)G-菌及G+菌均有較好的抑菌活性。在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)天蠶素類(lèi)抗菌肽的作用機(jī)制以及抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的假說(shuō)，設(shè)計(jì)了雜合肽cecA-mag的三個(gè)突變體并利用重組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定點(diǎn)誘變技術(shù)，使突變體得以合成，利

6、用瓊脂孔擴(kuò)散法檢測(cè)cecA-mag和其突變體對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效價(jià).試驗(yàn)結(jié)果顯示，三個(gè)突變體的抑菌活性比cecA-mag分別提高了1.2、1.2、1.5倍。
　　 3.畢赤酵母SMD1168菌株由于蛋白酶A和羧肽酶Y活性全部缺失，僅存部分蛋白酶B活性，該特性非常有利于發(fā)酵液中重組抗菌肽表達(dá)物的穩(wěn)定，較之X-33、GS115兩種酵母菌株，更適合表達(dá)抗菌肽之類(lèi)的生物活性小肽，本實(shí)驗(yàn)選用SMD1168畢赤酵母菌株表達(dá)Cecropi

7、nB以及其串聯(lián)體基因和cecA-mag的三個(gè)突變體基因抗菌肽.對(duì)上述六種重組酵母菌的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了表達(dá)優(yōu)化，結(jié)果表明重組酵母菌在BMGY培養(yǎng)基中增殖OD600為5～6時(shí)轉(zhuǎn)接BMMY培養(yǎng)基；BMMY培養(yǎng)基pH值為6.0，28℃培養(yǎng)60 h；補(bǔ)加1.0％甲醇；可提高重組抗菌肽的表達(dá)量和抗菌活性。抑菌試驗(yàn)，證明重組基因工程抗菌肽對(duì)G+和G-均具有良好的活性.酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所表達(dá)的重組抗菌肽在pH等于3.5時(shí)仍然有很好的活性，熱穩(wěn)

8、定性實(shí)驗(yàn)顯示，重組抗菌肽100℃加熱5 min，仍有活性，基于這樣的特性該抗菌肽有望在飼料和食品添加劑中得到很好的應(yīng)用。重組抗菌肽的體外穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，所研制成功的六種基因工程抗菌肽在4℃到保存30天仍有良好的活性，從而提示4℃是其最佳的保存方式。目前為止，還沒(méi)有對(duì)抗菌肽的單位有權(quán)威的最后報(bào)道，表達(dá)量的高低也不能簡(jiǎn)單的等同為活性的強(qiáng)弱，所以筆者認(rèn)為濃度單位可能是恰當(dāng)?shù)挠脕?lái)衡量其活性的方式，所以對(duì)研制成功的六種基因工程抗菌肽單位應(yīng)用MIC

9、來(lái)初步表示.大腸桿菌的MIC的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：cecA-mag、cecA-mag-mu-1、cock-mag-mu-2，cecA-mag-mu-3、cccB、3×cecB對(duì)大腸桿菌的MIC分別為：0.92、0.73、0.75、0.69、0.5、0.41μM。在此基礎(chǔ)上對(duì)合成的六種基因工程抗菌肽的抗菌譜進(jìn)行了完善。對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用通過(guò)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)有了系統(tǒng)的了解，通過(guò)曲線(xiàn)顯示對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在cecB和cecA-m

10、ag在40μg mL-1的使用劑量下上述兩種細(xì)菌得到完全抑制!
　　 4.以普通1日齡萊杭蛋雛雞為研究對(duì)象，將120只雛雞分為6個(gè)組，每組20只，其中不同劑量抗菌肽治療組又分為口服和肌肉注射兩個(gè)不同的處理，每個(gè)處理10只。研究了重組抗菌肽CecropinB治療雛雞大腸桿菌感染的效果。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，初步確定了選用的大腸桿菌對(duì)雛雞的最小致死劑量（MLD100）為1×107個(gè)細(xì)菌。最小致死劑量（1×107個(gè)細(xì)菌/mL）大腸桿菌肌肉注射2

11、4h后，肌肉注射和口服不同濃度的重組cecropinB抗菌肽，連續(xù)治療5天。結(jié)果表明，重組抗菌肽CecropinB對(duì)大腸桿菌有較好的治療效果。其中高劑量（0.75mL）的口服組的效果最佳，其治療效果要優(yōu)于市面上出售的獸用鹽酸環(huán)丙沙星效果，治愈率達(dá)到80％，中劑量（0.5mL）的口服組與高劑量肌肉注射組的治愈率相同為70％。中劑量肌肉注射組與環(huán)丙沙星組效果一致，治愈率達(dá)到60％，低劑量抗菌肽治療組，治療效果不如上述的所有治療組，說(shuō)明所研制

12、的基因工程抗菌肽在治療大腸桿菌感染時(shí)存在一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。與感染對(duì)照組相比，所有組別的雛雞死亡率顯著降低，抗菌肽高、中、低劑量組的有效率、治愈率與環(huán)丙沙星組差異不顯著。
　　 5.抗菌肽作為生物體先天性免疫的主要組成成份，在抵御外來(lái)病原侵襲中發(fā)揮著重要作用，特別是兩棲類(lèi)和昆蟲(chóng)類(lèi)，缺乏高效精確的細(xì)胞免疫系統(tǒng)，所以抗菌肽就成了其免疫防御系統(tǒng)的關(guān)鍵成份?？咕膶?duì)細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲(chóng)及癌變細(xì)胞都具有廣泛的殺傷活性。將250羽健康蛋雛

13、雞隨機(jī)分成5組，每組50羽，其中鹽酸環(huán)丙沙星組為抗生素對(duì)照組，空白對(duì)照組不添加任何成份，合成的基因工程抗菌肽cecropinB高、中、低三個(gè)劑量以飲水混飲的方式飼喂，高中低劑量分別為2、4、8ml L-1對(duì)實(shí)驗(yàn)各組雞的免疫器官指標(biāo)以及體重增重進(jìn)行了測(cè)試和分析，結(jié)果表明，所選用的抗菌肽高中低劑量組都不同程度的增強(qiáng)了雞的平均日增重，不同劑量之間差異顯著（P<0.01），對(duì)雛雞免疫功能的增強(qiáng)作用通過(guò)脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)三個(gè)指標(biāo)得以體

14、現(xiàn)，以高劑量組的增強(qiáng)作用最為明顯。此外，對(duì)基因工程抗菌肽CecropinB對(duì)雞巨噬細(xì)胞的吞噬能力進(jìn)行了探討。SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，高劑量組吞噬率與其它各組比較，差異顯著（P>0.05）；高劑量組吞噬指數(shù)與藥物對(duì)照組比較，差異顯著（P>0.05），總體看來(lái)，實(shí)驗(yàn)組的吞噬率和吞噬指數(shù)高于對(duì)照組，尤其是高劑量組吞噬率和吞噬指數(shù)明顯高于對(duì)照組，吞噬率和吞噬指數(shù)是巨噬細(xì)胞吞噬功能的具體表現(xiàn)，從而說(shuō)明基因工程抗菌肽CecropinB可以提高雞巨噬細(xì)

15、胞的吞噬能力。這一研究結(jié)果為基因工程抗菌肽的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 6.動(dòng)物腸道內(nèi)棲息著復(fù)雜多樣的微生物區(qū)系，該區(qū)系對(duì)宿主的生長(zhǎng)、健康具有重要意義.為研究CecropinB對(duì)雛雞腸道微生物區(qū)系的影響，試驗(yàn)將250只1日齡雛雞隨機(jī)分成五個(gè)處理組，每個(gè)處理組50只，試驗(yàn)組以混飲的方式飼喂不同濃度的CecropinB，對(duì)照組也以混飲的方式飼喂鹽酸環(huán)丙沙星，空白對(duì)照組飲水中不添加任何成份。用量和飼喂方法同上。分別于42、49d取盲

16、腸、回腸內(nèi)容物進(jìn)行PCR-DGGE，對(duì)腸道的幾種優(yōu)勢(shì)菌的多樣性進(jìn)行了研究.分析結(jié)果表明，飼喂含CecropinB對(duì)雛雞盲腸、回腸中微生物種群種類(lèi)未產(chǎn)生明顯的影響，各組雞腸道中微生物種群類(lèi)型既具有一定的相似性，又存在一定的差異.對(duì)回腸內(nèi)容物16SrDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序顯示，飼喂CecropinB的高劑量組比空白對(duì)照組多了一條與厭氣彎桿菌同源性為78％的條帶，其具體原因和機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示，CecropinB作為一種飼料