氟誘導小鼠睪丸間質細胞凋亡及機制研究.pdf

1、目的:氟(Flurine)是一種非金屬元素,也是人體必需的一種微量元素。氟具有強大的電負性,以氟化物(Fluoride)的形式廣泛存在于自然界中。攝入適量的氟有利于機體預防齲齒、維持鈣磷代謝和保持神經沖動傳導,而過量的氟化物則對機體產生強烈的毒性作用,能引起機體多系統損害。過去,人們多以氟對骨相組織的損害為研究重點,但近年來,隨著氟化物在工農業(yè)生產和生活中的廣泛應用,氟對機體生殖系統等非骨相組織的毒性作用逐漸被人們所重視。因此,關于氟致

2、雄性生殖毒性的研究日益受到關注。
　　 本課題通過動物體內和體外兩部分實驗,研究氟中毒對睪丸組織及間質細胞凋亡的影響。通過建立氟中毒小鼠模型,研究對小鼠睪丸組織損傷和細胞凋亡的影響；建立并優(yōu)化睪丸間質細胞培養(yǎng)條件與方法,觀察不同凍存復蘇條件對細胞生物學特性的影響；觀察不同濃度氟化鈉對睪丸間質細胞增殖和細胞凋亡的影響及其相關蛋白表達,為氟中毒的機制研究提供依據。
　　 方法:
　　 (1)體內實驗:動物體內實驗采用

3、給小鼠飲用含0,10,25,50mg／L氟化鈉的加氟水,制作動物中毒模型,觀察動物臨床表現及病理切片,研究氟對睪丸組織的損傷,并用原位細胞凋亡標記技術,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL法)檢測小鼠睪丸細胞凋亡的變化。
　　 (2)體外實驗:采用2種酶消化法分離純化睪丸間質細胞并尋求較適宜的培養(yǎng)條件,原代培養(yǎng)細胞經傳代、凍存與復蘇,倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學特征。取體外培養(yǎng)的睪丸間質細胞,胰酶消化后制

4、成單細胞懸液,常規(guī)培養(yǎng),待細胞融合率達80％,且未出現細胞分化時,將細胞分為4組,加入不同濃度的氟化鈉染毒(0,5,10,20mg／L)睪丸間質細胞,分別染毒0,24,48,72,96,120h后采用MTT法檢測各組細胞的增殖情況,觀察細胞的形態(tài)變化。染毒48h后采用流式細胞儀AnnexinV-PI雙染法檢測細胞凋亡率。采用免疫組織化學法檢測氟對小鼠睪丸質細胞的凋亡作用,檢測Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白

5、的表達水平。
　　 結果:
　　 (1)氟中毒能誘導小鼠睪丸TUNEL陽性細胞,且高氟組凋亡細胞率較對照組明顯增高。
　　 (2)膠原酶Ⅳ和0.25％胰蛋白酶限時消化能夠獲得較高存活率(>92％)的小鼠睪丸間質細胞；37℃、5％CO2條件下細胞生長良好,采用逐步降溫法和使用DMSO為凍存劑細胞復蘇率較高。
　　 (3)氟作用24h,48h后,20mg／L的氟對睪丸間質細胞增殖率有明顯抑制作用,而5mg／L

6、和10mg／L的組沒有明顯影響；10mg／L氟作用72h后,明顯抑制睪丸間質細胞的增殖；5,10,20mg／L各濃度氟作用96h和120h后均表現明顯抑制作用。
　　 (4)不同濃度氟對睪丸間質細胞作用48h后,均可誘導小鼠睪丸間質細胞凋亡。氟濃度為10mg／L時,晚期凋亡率最高。氟濃度為20mg／L時,早期凋亡率最高。
　　 (5)免疫細胞化學實驗表明:隨氟濃度的增加Caspase-3、Caspase-9、Bax陽性表

7、達率增加,灰度值降低,蛋白表達增強；Bcl-2陽性表達率降低,灰度值升高,蛋白表達減弱。
　　 結論:
　　 (1)本研究表明氟中毒可誘導小鼠睪丸組織細胞凋亡,凋亡發(fā)生部位與病理改變明顯的部位相吻合,并且睪丸損害過程中有細胞凋亡機制參與。
　　 (2)建立了睪丸間質細胞體外培養(yǎng)體系,為進一步研究氟中毒提供技術方法和實驗依據。
　　 (3)氟對小鼠睪丸間質細胞的增殖有抑制作用,誘導小鼠睪丸間質細胞凋亡,并且