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文檔簡介
1、目的:
納米氧化鋅(Zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)在工業(yè)中廣泛應(yīng)用,其除對(duì)肝臟和神經(jīng)有毒性之外,還對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有毒性,但其確切機(jī)制仍不甚清楚。本課題主要通過觀察ZnO NPs對(duì)活體雄性小鼠睪丸組織和小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響,探究自噬在ZnO NPs誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。
方法:
用HE染色檢測ZnO NPs對(duì)小鼠睪丸及附睪的病理損傷,用Western
2、 blot檢測ZnO NPs對(duì)小鼠睪丸組織的凋亡和自噬的影響,活性氧檢測試劑盒檢測ZnO NPs對(duì)小鼠睪丸組織和小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。用ELISA法檢測ZnO NPs對(duì)小鼠血清睪酮含量的影響。用MTT法檢測ZnO NPs和H2O2對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞活性的影響;分別用Western blot和Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測ZnO NPs對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的影響;分別用Western blot和電鏡檢測Z
3、nO NPs和H2O2對(duì)TM3細(xì)胞自噬的影響。
結(jié)果:
用不同濃度的ZnO NPs(0,100,200,400 mg/kg/d)連續(xù)給小鼠灌胃28天后,與對(duì)照組相比,ZnO NPs對(duì)小鼠睪丸及附睪系數(shù)無明顯影響(P>0.05)。HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠睪丸生精細(xì)胞排列整齊、緊致;與對(duì)照組相比,100 mg/kg ZnO NPs處理組的小鼠睪丸生精細(xì)胞排列也比較整齊,并無明顯的生精細(xì)胞脫落;200及400 mg/k
4、g ZnO NPs處理組的小鼠睪丸生精細(xì)胞排列明顯紊亂、松散,并出現(xiàn)不同程度的脫落。ZnO NPs還顯著降低小鼠附睪中的精子數(shù)量。Western blot結(jié)果顯示, ZnO NPs可增加小鼠睪丸組織內(nèi) cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、Bax蛋白含量并抑制Bcl-2蛋白的表達(dá),提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織凋亡。ZnO NPs還可使小鼠睪丸組織內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3-II含量、LC3-II/LC
5、3-I的比例以及自噬相關(guān)蛋白Atg-5和 Beclin-1的表達(dá)顯著增加,提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織自噬。與對(duì)照組相比,ZnO NPs處理組小鼠睪丸組織中的MDA和GSH含量分別增加和降低;ZnO NPs還呈濃度依賴式地抑制小鼠睪丸組織內(nèi)SOD和GSH-PX的活性,提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激。ELISA結(jié)果顯示, ZnO NPs可顯著降低小鼠血清中睪酮含量(P<0.05),提示ZnO NPs可能影響睪丸間
6、質(zhì)細(xì)胞的功能。
體外實(shí)驗(yàn)表明,ZnO NPs呈濃度依賴式地抑制小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞活性(P<0.05),并顯著增加TM3細(xì)胞內(nèi)cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和Bax蛋白含量和抑制細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá),提示ZnO NPs可誘導(dǎo)TM3細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC和PI雙染色法進(jìn)一步證實(shí)ZnO NPs可誘導(dǎo)TM3細(xì)胞凋亡。ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激(P<
7、0.05);H2O2在顯著抑制TM3細(xì)胞活性的同時(shí)(P<0.05),還可誘導(dǎo)TM3細(xì)胞凋亡,而在用N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激后,ZnO NPs對(duì)細(xì)胞活性的抑制和凋亡的誘導(dǎo)作用均明顯減弱。以上結(jié)果顯示,氧化應(yīng)激參與了ZnO NPs對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。Western blot結(jié)果顯示,ZnO NPs和H2O2可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞自噬,用NAC抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激后,Z
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