miR-146a對前列腺癌糖代謝功能影響的研究及其表達調控機制.pdf

1、前列腺癌是一個多病因且復雜的常見病，是威脅男性健康的常見腫瘤。在我國，隨著人口老齡化的加劇，前列腺癌的發(fā)病率逐年遞增。前列腺癌已成為威脅中國男性健康的主要疾病之一。近年來，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的分子生物學理論發(fā)生了重大變革，也使人們對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制有了新的認識。在這個過程中，miRNA以其重要的診斷和治療價值給前列腺癌的研究帶來了新的曙光。
　　本課題組前期通過miRNAs芯片篩選發(fā)現(xiàn)，相對于正常前列腺組織和雄激素依

2、賴性前列腺癌組織而言，去勢抵抗性前列腺癌組織中miR-146a的表達水平偏低，并且通過定量PCR手段在臨床前列腺癌切除標本上驗證了這一結果。后通過分析MSKCC數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)轉移性前列腺癌中miR-146a表達水平低于局限性癌，同時Gleason=8分癌組織中miR-146a表達水平低于Gleason＜8分的癌組織。并且癌組織低表達miR-146a的患者在根治手術后生化復發(fā)風險更高。我們通過細胞生物學實驗驗證了miR-146a能夠抑制

3、前列腺癌的增殖、侵襲及遷移等生物學功能，以及誘導癌細胞凋亡的能力，并且抑制癌細胞的體外成瘤能力。糖酵解代謝作為前列腺癌細胞的重要代謝特征之一，其過程中的分子調控機制暫時不完全明確。且miR-146a分子對前列腺癌糖代謝功能的影響尚未有研究和定論。
　　在第一部分中，我們通過向前列腺癌細胞(PC3和DU145)內(nèi)轉染miR-146a mimics后進行細胞內(nèi)ATP檢測、上清液乳酸生成量和葡萄糖濃度檢測、糖酵解速度檢測等手段檢測了mi

4、R-146a對前列腺癌細胞糖代謝能力的影響。結果發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠降低前列腺癌細胞的葡萄糖攝取能力，同時降低細胞的ATP生成量，并且降低糖酵解代謝生成的乳酸量。通過XF96儀器檢測細胞外酸化速度發(fā)現(xiàn)miR-146a抑制了前列腺癌細胞的糖酵解能力。整理和分析GEO數(shù)據(jù)庫中GSE35988數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，己糖激酶2（HK2）在前列腺良性增生切除的標本中的表達水平顯著性低于雄激素依賴性前列腺癌和去勢抵抗性前列腺癌，同時去勢抵抗性前列腺癌組織中

5、HK2的表達水平高于雄激素依賴性前列腺癌組織。在前列腺癌細胞中用siRNA下調HK2蛋白質的表達后，發(fā)現(xiàn)細胞的ATP生成量減少，糖酵解產(chǎn)生的乳酸量下降，葡萄糖攝取能力下降，上機檢測細胞外酸化速度發(fā)現(xiàn)，細胞的糖酵解能力下降。我們通過熒光素酶報告基因及Western bloting證實HK2是miR-146a的靶基因，通過向細胞中轉染miR-146a后恢復性表達HK2蛋白，發(fā)現(xiàn)癌細胞的葡萄糖攝取能力回升，同時糖酵解生成的乳酸量回升，ATP產(chǎn)

6、量回升，機器檢測發(fā)現(xiàn)癌細胞的糖酵解能力得到了恢復。由此我們證明在前列腺癌細胞中，miR-146a通過靶向下調HK2蛋白的表達，抑制細胞糖酵解能力。
　　聯(lián)合本課題組的所有實驗結果，miR-146a的抑癌作用已被研究和證明。但miR-146a在前列腺癌中的表達調控機制仍不十分明確，因此第二部分將研究重心放在了miR-146a的表達機制的調控上。
　　第二部分中，我們通過UCSC生物信息數(shù)據(jù)庫，預測了miR-146a轉錄因子YY

7、1。通過分析ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織的YY1表達水平高于正常前列腺組織，轉移性前列腺癌組織中YY1表達水平亦高于原位前列腺癌。分析Nakagawa上傳的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)且前列腺癌根治術后生化復發(fā)的患者癌組織中YY1的表達水平顯著高于非生化復發(fā)組，且YY1的表達水平隨著Gleason評分升高。我們選取45例臨床前列腺癌組織，利用免疫組化技術檢測石蠟切片中YY1蛋白的表達，同時利用原位雜交技術檢測石蠟切片中miR-146a分子的表

8、達，量化統(tǒng)計結果后分析發(fā)現(xiàn)miR-146a與YY1的表達呈負相關(P=0.007)。
　　通過敲低PC3細胞YY1表達后，提取細胞總RNA，測序獲得全轉錄組RNA數(shù)據(jù)，并通過基因探針富集分析(GSEA)發(fā)現(xiàn)miR-146a靶基因RNA水平呈現(xiàn)了負向富集(NES=-1.039，F(xiàn)DR=0.267，P=0.15)，而EZH2抑制的基因集發(fā)生正向富集(NES=1.34，F(xiàn)DR=0.02，P=0.02)。同時通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)下調

9、YY1表達后，miR-146a的表達水平顯著升高(P＜0.05)。
　　我們構建miR-146a初始轉錄本上游序列報告基因質粒(-1226～36bp)，通過熒光素報告基因實驗和染色質免疫共沉淀實驗驗證了YY1對miR-146a的轉錄抑制調控。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)YY1和EZH2同時下調后miR-146a的表達進一步升高。最后通過提取細胞核蛋白，實施蛋白質共沉淀實驗驗證了YY1聯(lián)合EZH2參與miR-146a的轉錄抑制過程。綜上第