藍靛果花色苷?；N選育及衍生物結構與功能的研究.pdf

1、U n i v e r s i t yC o d e ：1 0 2 2 5R e g i s t e rC o d e ：D i s s e r t a t i o nf o r t h eD e g r e e o f M a s t e rR e s e a r c h e d o nS e l e c t i n g E d u l i sA n t h o c y a n i n s A c y l a t e dS t r a

2、 i na n d C h a r a c t e r i z i n g D e r i v a t i v e sS t r u c t u r e a n d1 n ·‘量In n c t i o nC a n d i d a t e ： Z h a n g z h iS u p e r v i s o r ：哳徹q 動朗一) ，uA s s o c i a t eS u p e r v i s o r ：A c a d

3、 e m i c D e g r e e A p p l i e d f o r ：D o c t o r o f A g r i c u l t u r eS p e c i a l i t y ： F o r e s tP l a n tR e s o u r c e sD a t e o f 0 r a l E x a m i n a t i o n ： J u n e ，2 0 1 鼉：U n i v e r s i t y ：

4、， N o r t h e a s t F o r e s t r y U n i v e r s i t y摘要1 1 1 1 1 I l l l 1 1 1 1 1 1 1 I I II I I I I I I I I I {Y 2 0 2 6 8 4 3 ：摘要藍靛果( L o n i c e r a e d u l i s T u r c z ) 在植物分類學上屬忍冬科( C a p r i f o l i a c e a e

5、) 忍冬屬( L o n i c e r a L ．) 。經(jīng)臨床試驗證明，對心腦血管疾病有一定療效，并具有抗病毒、抗腫瘤、肝臟解毒等功能。藍靛果花色苷屬于多酚類衍生物中的花青素類，它被廣泛應用于食品、飲料、化妝品當中，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。但天然藍靛果花色苷穩(wěn)定性較差，受光照、溫度、p H 等環(huán)境因素影響比較大。如果天然花色苷的糖基被?；?，則會形成穩(wěn)定的“三明治”結構。本論文旨在通過微生物轉化，改變花色苷結構進而增強其穩(wěn)定性和生物

6、活性功能，從而擴大它的應用范圍和領域。通過以下試驗得到了一條可使天然花色苷穩(wěn)定性明顯增強的生物轉化途徑。( 1 ) 通過對收集的1 3 2 株菌種的篩選，得到可增加藍靛果花色苷穩(wěn)定性的菌種兩株，經(jīng)分子生物學鑒定分別為：假絲酵母C a n d i d a s a i t o a n a S X ．1 l 和枯草芽孢桿菌B a s f l l u ss u b t i l i sB 1 0 5 ；分別對其理化復合誘變，篩選到使花色苷保存率更

7、高的變異新菌株S X ．1 1 6 0 和枯草芽孢桿菌L D ．B 1 0 5 ，通過傳代試驗證明S X ．I1 6 0 和L D —B 1 0 5 的遺傳性狀穩(wěn)定( 2 ) 在S X ．1 1 6 0 和L D ．B 1 0 5 的花色苷轉化培養(yǎng)液中，分別進行了添加芳香族、脂肪族等酸類、常見金屬離子和部分氨基酸等作為輔色素，用以增強花色苷保存率的研究。結果表明，添加0 ．5 m o l ／L 對羥基苯甲酸，L D ．B 1 0 5 轉

8、化的花色苷在紫外圖譜中發(fā)生紅移并產(chǎn)生增色效應，且在連續(xù)高溫光照6 d 后，保存率為8 8 ．0 1 ％，而不加輔色素保存率僅為4 8 ．9 7 ％，加入對羥基苯甲酸保存率提高了1 ．．8 倍。但針對S X - 1 1 6 0 的生物轉化過程沒有找到合適的酰化供體。( 3 ) 采用P E R 技術從B a c i l l u ss u b t i l i sL D —B 1 0 5 中擴增獲得花色苷?；^程中的關鍵酶一酰胺連接酶的基因，

9、命名為a c y B 、a c y C 、a c y A 。P C R 擴增共獲得大小為1 6 4 6 b p 的兩段基因片段。其中一段為a c y B ，序列長1 1 8 2 b p ，包含一個完整的基因開放閱讀框，共編碼3 9 3 個氨基酸；另一段a c y C 序列，序列長為4 4 6 b p ：a c y A 全長1 1 5 2 b p ，編碼3 8 3 個氨基酸。將a c y A 、a c y B 和a c y C 基因克隆到

10、p M D l 9 一T 載體上，經(jīng)藍白斑篩選和酶切鑒定選擇陽性克隆進行測序分析，并推導出氨基酸序列，進行了生物信息學分析。( 4 ) 通過優(yōu)化生物轉化條件：篩選菌株L D ．B 1 0 5 在葡萄糖1 ．O ％、K ．H 2 P 0 4 0 ．1 ％、M g S 0 4 0 ．0 5 ％、對羥基苯甲酸0 ．5 m o l ／L 、p H 5 的培養(yǎng)基中，調(diào)整初始培養(yǎng)基5 1 0 n m 吸光值0 ．6 左右，3 5 “ ( 2 ，l

11、l O r p m ，轉化7 2 h ：轉化后將發(fā)酵液4 0 0 0 r p m 離心3 0 r a i n ，取上清液，5 0 ℃光照6 d ，測定吸光值。結果顯示：優(yōu)化后藍靛果花色苷保存率為8 9 ．8 5 ％，未經(jīng)轉化的花色苷保存率為4 5 ．3 2 ％，轉化后的保存率是未轉化的2 倍。( 5 ) 應用大孔樹脂X ．5 和6 0 ．1 0 0 目聚酰胺，分離純化經(jīng)L D ．B 1 0 5 轉化的藍靛果花色苷發(fā)酵上清液，用4 0 ％