干細(xì)胞與血管損傷的基礎(chǔ)及臨床研究.pdf

1、一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性血管損傷研究
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是來源于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。其具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)等。MSCs移植后可遷移到多種組織，其具備的向ECs分化的特性為其促損傷血管內(nèi)膜修復(fù)提供了一定的理論

2、依據(jù)，但因其也具有向VSMCs分化的特性，使MSCs移植治療損傷血管的結(jié)局具有一定的不確定性。本研究通過靜脈移植的方法，探討MSCs在急性血管損傷修復(fù)中的作用及體內(nèi)的歸巢分化，并比較未經(jīng)誘導(dǎo)MSCs及誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮樣細(xì)胞(endothelial-like cells，ELCs)組的療效差異。體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。擴(kuò)增培養(yǎng)后，取用3-6代的MSCs。在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM-2)中加入50ng/ml的rVEGF164定向誘導(dǎo)M

3、SCs分化為ELCs。經(jīng)流式細(xì)胞儀、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光鑒定。采用12周300克重左右的SD大鼠，經(jīng)球囊損傷大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈制備頸動(dòng)脈急性損傷模型。應(yīng)用20umol/L BrdU孵育48小時(shí)標(biāo)記細(xì)胞。將大鼠模型分為3組，在手術(shù)當(dāng)天，分別經(jīng)股靜脈移植數(shù)量為2×106/ml經(jīng)標(biāo)記了BrdU的MSCs、ELCs及PBS。在移植后7天，14天及28天，采用小動(dòng)物專用高分辨率超聲顯像儀觀察損傷頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成情況。隨后取材、連續(xù)石蠟及冰凍切片

4、，觀察損傷動(dòng)脈病理組織形態(tài)學(xué)的變化以及應(yīng)用免疫組化及免疫熒光觀察MSCs的歸巢及分化。形態(tài)學(xué)觀察顯示，誘導(dǎo)后的MSCs可見類似內(nèi)皮細(xì)胞樣改變，并表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志vWF，CD31，CD34，VEGFR2。小動(dòng)物超聲檢查顯示，術(shù)后14天經(jīng)MSCs體外誘導(dǎo)分化的ELCs組的內(nèi)膜-中層厚度(IMT)較PBS組及未誘導(dǎo)組明顯降低(0.10士0.02mm vs0.14士0.03mm vs0.13士0.02mm，p＜0.01)，在術(shù)后2

5、8天這種表現(xiàn)更為明顯(0.16±0.02mm vs0.22±0.04mm vs0.23士0.05，p＜0.01)。術(shù)后28天，石蠟病理切片Masson染色顯示，移植ELCs組新生內(nèi)膜面積/中層面積(I/M ratio)較PBS組及未誘導(dǎo)組明顯減少（1.22±0.23 vs2.52±0.64 vs2.87±0.40，p＜0.001）。免疫組化標(biāo)記anti-BrdU顯示，在損傷動(dòng)脈的外膜側(cè)有大量的歸巢細(xì)胞，尤以外膜滋養(yǎng)血管處為甚，滋養(yǎng)血管內(nèi)

6、亦可見移植細(xì)胞，其次為新生內(nèi)膜處，而血管中膜幾乎未見移植細(xì)胞，提示移植細(xì)胞的歸巢主要集中在損傷動(dòng)脈的外膜部分，可能部分通過滋養(yǎng)血管到達(dá)新生內(nèi)膜部分。MSCs組在損傷動(dòng)脈外膜側(cè)可見較多α-smooth muscle actin陽性的BrdU標(biāo)記細(xì)胞，提示移植的MSCs在體內(nèi)可能分化為平滑肌樣細(xì)胞；而ELCs組則見較多CD31陽性移植細(xì)胞，提示體外分化的ELCs在體內(nèi)仍保持內(nèi)皮細(xì)胞特征。
　　 二、原發(fā)性高血壓患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞、內(nèi)

7、皮功能及靶器官損害的研究
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，近年來發(fā)現(xiàn)循環(huán)EPCs與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系；血流介導(dǎo)的血管舒張功能(FMD)是反應(yīng)內(nèi)皮功能良好的檢查手段，內(nèi)皮功能障礙與高血壓的關(guān)系正日益受到重視。本研究通過觀察原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮功能及循環(huán)EPCs數(shù)量的改變，分析影響血管內(nèi)皮功能及EPCs的危險(xiǎn)因素，并初步探討靶器官受累情況與內(nèi)皮功能不全及EPCs的關(guān)系。 本研究入選280名原發(fā)性

8、高血壓患者，其中男性175位，女性128位（59士8vs60±10歲）。根據(jù)2007年歐洲高血壓指南靶器官損害的診斷標(biāo)準(zhǔn)，按靶器官損害數(shù)量將高血壓患者分為4組：無靶器官損害組(n=61)，1個(gè)靶器官損害組(n=113)，2個(gè)靶器官損害組(n=59)及3個(gè)以上靶器官損害組(n=47)。高頻血管超聲檢測(cè)右上肢肱動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性(血流介導(dǎo)血管舒張，F(xiàn)MD)和非內(nèi)皮依賴性舒張功能（硝酸甘油介導(dǎo)血管舒張，NTG）。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD133+

9、/KDR+細(xì)胞定義為EPCs。所有患者同時(shí)檢查頸總動(dòng)脈內(nèi)膜一中層厚度(IMT)，頸-股動(dòng)脈脈搏波速度(cf-PWV)及左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）。FMD功能與靶器官受累情況密切相關(guān)。原發(fā)性高血壓無靶器官損害組FMD為11.88±7.11％，伴1個(gè)靶器官損害組FMD為10.00士6.15%，較無靶器官損害組有明顯下降(p＜0.01)；2個(gè)靶器官損害組FMD7.37士5.02%，較1個(gè)靶器官損害組也有顯著下降(p＜0.01)；而3個(gè)以上靶器官

10、損害組(6.85±4.70%)較2個(gè)靶器官損害組的FMD稍有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.7)。NTG在2個(gè)及3個(gè)以上靶器官損害組較無靶器官損害組均有顯著下降（8.31士5.42%vs12.57±7.60%，p＜0.01；8.78士6.46%vs12.57±7.60%，p＜0.01）。逐步多元回歸分析顯示，F(xiàn)MD與腰圍(β=-0.283，p＜0.01），年齡(β=-0.231，p＜0.05)及IMT(β=-0.197，p=0.05)明顯