骨折及軟骨損傷后干細胞遷移機制研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質干細胞遷移至小鼠長干骨骨折部位促進骨折愈合過程中遷移及修復的研究
　　一、目的:
　　本研究在建立小鼠股骨閉合型骨折模型的基礎上,觀察骨折后干細胞向骨折斷端歸巢的現(xiàn)象,研究干細胞歸巢后的轉歸及作用機制;觀察骨折后不同時間點注射間充質干細胞對骨折愈合的影響,為注射干細胞修復骨折提供臨床應用參考。
　　二、方法:
　　1、設計制作設備,建立小鼠股骨閉合型骨折內固定模型。
　　2、使用PCR方法

2、檢測小鼠骨折后趨化因子的表達時間變化。
　　3、建立 Transwell細胞遷移模型,檢驗骨折組織勻漿對骨髓間充質干細胞遷移的趨化作用,使用SDF-1/CXCR4軸特異性阻斷劑AMD3100檢驗SDF-1的促遷移作用。
　　4、建立小鼠股骨閉合骨折內固定模型,經尾靜脈注射表達紅色熒光蛋白的骨髓間充質干細胞,使用熒光成像技術、冰凍切片及病理學方法觀察骨髓間充質干細胞是否通過機體血液循環(huán)歸巢至骨折端,應用免疫熒光和Western

3、-blot檢測方法檢查骨髓間充質干細胞的轉歸,應用 SDF-1的受體 CXCR4的特異性阻斷劑AMD3100進一步驗證SDF-1/CXCR4通路對骨髓間充質干細胞歸巢的動員機制。
　　5、通過不同時間點向小鼠股骨閉合骨折內固定模型行尾靜脈注射表達紅色熒光蛋白的骨髓間充質干細胞,使用熒光成像方法、Micro-CT、生物力學檢測尋找注射外源性骨髓間充質干細胞促骨折愈合的最佳時間點。
　　三、結果:
　　1、成功自制閉合型骨

4、折制備器,建立可靠的小鼠股骨閉合型骨折內固定模型。
　　2、小鼠骨折后0,3,7,14,28d骨折端組織提取物的趨化因子 SDF-1和MCP-3的mRNA表達均在7d達高峰, TGF-β1也在7天開始升高。
　　3、小鼠骨折后7d骨折斷端的組織勻漿可以在體外Transwell模型中促進骨髓間充質干細胞的遷移,該趨化作用可以被AMD3100阻斷。
　　4、小鼠骨折后7d尾靜脈注射表達紅色熒光蛋白的骨髓間充質干細胞向骨折端

5、局部遷移,42d后仍能觀察到熒光細胞表達。骨髓間充質干細胞歸巢到骨折端骨內膜處,表達成骨相關因子OPN,OCN及趨化因子SDF-1。并促進成骨相關因子BMP2,TGF-β1及VEGF的表達。術后14d及42d標本取材固定后HE染色及Masson三色染色顯示骨折愈合明顯增快增強。骨折端組織對BMSCs的趨化作用,可以被SDF-1/CXCR4軸阻斷劑AMD3100阻斷。
　　5、術后7d在小鼠股骨閉合骨折內固定模型行尾靜脈注射表達紅色

6、熒光蛋白的骨髓間充質干細胞,熒光成像光密度值、BMD,BV,BVF,最大載荷,最大橈度,彈性橈度和剛度等指標均優(yōu)于術后1d或14d。
　　四、結論:
　　1、自主研制的骨折制備器可成功模擬小鼠閉合性股骨固定。并行髓內固定。觀察骨折愈合全過程,符合骨折軟骨內成骨愈合進程。
　　2、骨折端組織在第7d時主要趨化因子的表達都在高值。支持術后7d注射骨髓間充質干細胞為最佳注射時機。
　　3、Transwell細胞侵襲試驗

7、說明SDF-1/CXCR4通路在促細胞遷移方面起到重要作用。
　　4、系統(tǒng)注射間充質干細胞遷移至骨折斷端骨內膜處并長時間增殖表達,自身表達促成骨因子,也促進旁分泌成骨因子,明顯促進骨折愈合。 SDF-1/CXCR4通路在其中起到重要作用。
　　5、骨折術后7d注射間充質干細胞較術后1d及14d為促進骨折愈合最佳注射時機。
　　第二部分間充質干細胞在軟骨損傷中遷移現(xiàn)象及機制的研究
　　一、目的:
　　研究軟骨

8、損傷后骨髓間充質干細胞向軟骨下骨下歸巢的現(xiàn)象及其可能機制。
　　二、方法:
　　1、制作大鼠股骨滑車直徑2mm,深1mm骨軟骨缺損模型。
　　2、術后向關節(jié)腔注射106/0.2ml表達紅色熒光蛋白的骨髓間充質干細胞。
　　3、術后1、2、3、7d股骨髁取材,行冰凍切片,Hochest33258染色后在熒光顯微鏡下觀測,觀察骨髓間充質干細胞分布。
　　4、術后3、7、14、21d,取骨髓間充質干細胞注射組及生

9、理鹽水注射組關節(jié)囊內滑膜及髕下脂肪墊組織行蛋白芯片檢測。取股骨髁間軟骨缺損周圍4×4×2mm范圍骨軟骨組織,立即液氮下研磨后提取RNA行RT-PCR檢測趨化因子。
　　5、術后3m,待缺損纖維愈合后再次注射106/0.2ml骨髓間充質干細胞。術后1、2、3、7d股骨髁取材,行冰凍切片,Hochest33258染色后在熒光顯微鏡下觀測,觀察骨髓間充質干細胞分布。
　　三、結果:
　　1、缺損術后并注射RFP-BMSCs后

10、1、2d,BMSC出現(xiàn)在軟骨缺損區(qū)。3d后進入軟骨下骨下骨髓腔,軟骨缺損區(qū)保留少。
　　2、缺損術后3m,缺損區(qū)纖維修復再次注射 RFP-BMSC后7d內未見到RFP-BMSC遷移到缺損區(qū)及軟骨下骨區(qū)。
　　3、缺損術后并注射骨髓間充質干細胞組3、7d關節(jié)囊內滑膜及髕下脂肪組織內炎癥因子表達均高于未干預組。干細胞注射組軟骨缺損區(qū)周圍趨化因子表達也高于未干預組。
　　四、結論:
　　大鼠股骨髁軟骨全層缺損后注射骨髓