脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用探討.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞屬于一種多能干細(xì)胞,其不但可以分化成多個(gè)胚層組織細(xì)胞,而且還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)特性,因此,無疑成為組織工程和治療免疫因素介導(dǎo)疾病的良好工具。骨髓雖然是間充質(zhì)干細(xì)胞最常見來源,但取材復(fù)雜,獲取困難。國內(nèi)外眾多學(xué)者已在成體的多種組織中分離出類似骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞亞群。脂肪組織作為最容易獲得的成體組織,可能成為最具吸引力、能夠分離間充質(zhì)干細(xì)胞的備選組織之一。
　　 本研究的第一部分旨在研究成體脂肪組織中是否和骨髓一樣

2、也存在具有多能性的間充質(zhì)干細(xì)胞。我們通過運(yùn)用免疫磁珠分選和極限稀釋的方法,從成體脂肪組織中分離得到-Flk1+CD31-CD34-的多能干細(xì)胞的亞群,誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)顯示,該細(xì)胞在單細(xì)胞水平上體外可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及肝上皮樣細(xì)胞定向分化。免疫表型分析的結(jié)果顯示,這些細(xì)胞高表達(dá)Flk1、CD105、CD44及CD29,但不表達(dá)vWF、CD31、CD34、CD45、CD11a、CD11b、CD117、HLA-ABC及HLA-DR。這與骨髓

3、來源的Flk1+CD31-CD34-成體干細(xì)胞的表型基本一致；瑞氏-吉姆薩染色后可見,脂肪來源的干細(xì)胞,形態(tài)上也基本與骨髓源Flk1+CD31-CD34-多能干細(xì)胞相似,呈成纖維樣；在對數(shù)生長期,細(xì)胞倍增時(shí)間與骨髓源Flk1+CD31-CD34-多能干細(xì)胞也基本一致,約為28小時(shí)。另外,我們的結(jié)果同時(shí)也提示,與骨髓源干細(xì)胞的分離純化相比,從同一體積的脂肪組織分離得到的成纖維樣集落細(xì)胞的數(shù)量是骨髓的10倍以上。既然骨髓源Flk1+CD31

4、-CD34-細(xì)胞和脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞具有相同的功能,成體脂肪組織就應(yīng)該更具應(yīng)用前景。
　　 第二部分旨在探討體外定向誘導(dǎo)成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的可能性。首先將成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞培養(yǎng)在含適當(dāng)濃度的B27、bFGF及EGF等因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo),接著更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基,采用含有適當(dāng)濃度的β細(xì)胞調(diào)節(jié)素、尼克酰胺等高糖無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化

5、,然后用RT-PCR法檢測誘導(dǎo)前后nestin,ngn3,IPF-1,胰島素,胰高血糖素基因的表達(dá)；用免疫組織化學(xué)法檢測誘導(dǎo)前后nestin,胰島素,胰高血糖素蛋白的表達(dá)；放射免疫分析法檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞分泌胰島素情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞經(jīng)過第一階段誘導(dǎo)后可分化成nestin陽性的祖細(xì)胞,再繼續(xù)誘導(dǎo)6d后變圓的細(xì)胞逐漸增多,且聚集成團(tuán),免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過這兩個(gè)階段誘導(dǎo)后的細(xì)胞能夠表達(dá)胰島素、胰高血糖素

6、、生長抑素等內(nèi)分泌激素,放免分析結(jié)果表明誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)能夠分泌胰島素。因此,成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞具有胰腺干祖細(xì)胞的固有特征,極有可能作為種子細(xì)胞用于糖尿病的細(xì)胞治療。
　　 本論文的第三部分旨在探索成體脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞作為滋養(yǎng)層能否促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖、分化,以及體內(nèi)脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞能否促進(jìn)機(jī)體造血功能恢復(fù)。以脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞為滋養(yǎng)

7、層,接種造血細(xì)胞,觀察細(xì)胞數(shù)及CFLJ-GM的變化。將脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞通過尾靜脈輸給預(yù)先經(jīng)137Cs全身照射0.35Gy的雌性C57BL/6小鼠,定期檢測外周血和骨髓細(xì)胞的總數(shù)以及CFU-GM變化。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示:實(shí)驗(yàn)組造血細(xì)胞總數(shù)及CFUJ-GM值在第2周即明顯的高于對照組,脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞能夠有效地支持造血細(xì)胞增殖及分化達(dá)6廚；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:聯(lián)合輸注脂肪源Flk1+CD31-C

8、D34-細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠,其外周血和股骨有核細(xì)胞數(shù)、CFLJ-GM值于第2周即明顯的高于單純照射組小鼠,第4周實(shí)驗(yàn)組小鼠部分骨髓細(xì)胞有Y染色體的表達(dá),提示在受體內(nèi)有供體細(xì)胞存在。因此,脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞能夠促進(jìn)照射小鼠的造血恢復(fù)。
　　 本論文的第四部分探討器官移植中脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的可能性。以CM-DM熒光染料示蹤脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況

9、,并以PCR的方法檢測Y染色體的存在以進(jìn)一步鑒定；以皮膚移植實(shí)驗(yàn)觀察脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞移植組小鼠對供者來源組織器官移植物的反應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞可以進(jìn)入并較長期(30天)存在于異基因小鼠的免疫器官內(nèi):在細(xì)胞移植組小鼠脾臟中可檢測到供者來源的T細(xì)胞占受者脾臟細(xì)胞的6.68％；脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞移植組的小鼠供者來源皮膚移植物存活>90d,未處理組平均為10d。因

10、此,異基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞移植后可形成穩(wěn)定的嵌和體,并誘導(dǎo)特異性的免疫耐受產(chǎn)生。
　　 本論文的第五部分,通過重建端粒酶活性延長脂肪源Flk1+CD31-CD34-干細(xì)胞的壽命,并對它的成骨潛能進(jìn)行研究,以期為骨組織工程提供種子細(xì)胞。首先,將人端粒酶催化亞基(hTERt)基因通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞,RT-PCR檢測hTERT mRNA的表達(dá),TRAP-PCR檢測細(xì)胞端

11、粒酶的活性。Von Kossa染色及RT-PCR檢測已重建端粒酶活性的脂肪源干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化潛能。結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染hTERT的脂肪源干細(xì)胞能夠穩(wěn)定地表達(dá)端粒酶活性。轉(zhuǎn)染后傳75代的細(xì)胞仍能維持著自我更新及向成骨細(xì)胞分化的潛能,且無惡性轉(zhuǎn)化傾向。因此,我們的結(jié)果提示,重建端粒酶活性可延長脂肪源干細(xì)胞的壽命并能維持其自我更新及成骨潛能,從而為建立骨組織工程標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系提供新的實(shí)驗(yàn)手段。
　　 本論文的第六部分,對6例發(fā)生慢性肝臟G

12、VHD的患者進(jìn)入臨床評估?；颊咴诃h(huán)孢霉素和糖皮質(zhì)激素治療無效后改用FK506治療慢性肝臟GVHD,然而,若干天后,患者又出現(xiàn)了進(jìn)行性腎功能受損,因此,停用FK506改用異基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞,相關(guān)生化檢測指標(biāo)顯示,肝臟GVHD及腎功能受損很快得以緩解?，F(xiàn)在,該6名患者生存狀況良好。
　　 本論文的第七部分旨在進(jìn)一步評價(jià)成人脂肪源干細(xì)胞作為挽救方案用于對糖皮質(zhì)激素耐藥的急性移植物抗宿主病的治療。6例對糖皮質(zhì)

13、激素耐藥的Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病患者均經(jīng)靜脈輸入成人脂肪源干細(xì)胞(劑量為1.0×106/kg),其中1例患者接受兩次成人脂肪源干細(xì)胞的輸注,其余5例患者均接受一次成人脂肪源干細(xì)胞治療。在這6例患者中,2例患者接受的成人脂肪源干細(xì)胞來源于HLA配型完全相合的家庭供著,其余4例患者接受無血緣關(guān)系的無關(guān)供者的成人脂肪源干細(xì)胞。結(jié)果:所有接受成人脂肪源干細(xì)胞治療的6例患者均無明顯副作用出現(xiàn)；在接受成人脂肪源干細(xì)胞治療的6例患者中,除1例患者