基質(zhì)彈性在確定急性心肌梗死后骨骼單個(gè)核細(xì)胞移植最佳時(shí)機(jī)中的作用.pdf

1、骨髓源細(xì)胞移植治療急性心肌梗死(AMI)的最佳時(shí)機(jī)問(wèn)題已引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。已有少量研究表明,移植時(shí)機(jī)的選擇是影響移植療效的重要因素。目前學(xué)術(shù)界傾向于最佳移植時(shí)機(jī)可能出現(xiàn)在AMI后一周左右的觀點(diǎn)。然而,其潛在機(jī)制尚不明確。
　　 近來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示,干細(xì)胞周?chē)奈锢砦h(huán)境(主要是基質(zhì)的彈性或硬度,用彈性模量[ElasticModulus,E]描述)決定著其生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)歸,即由不同彈性基質(zhì)誘導(dǎo)分化而來(lái)的細(xì)胞在形態(tài)和功能上更

2、接近于宿主組織的細(xì)胞。具體來(lái)說(shuō),類(lèi)似于腦組織的軟基質(zhì)能夠誘導(dǎo)骨髓源干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化;類(lèi)似于肌肉的中等彈性基質(zhì)能夠誘導(dǎo)其發(fā)生肌原性分化;類(lèi)似于骨膠原的硬基質(zhì)能夠刺激其骨原性分化。
　　 同時(shí),考慮到心肌梗死后由大量心肌壞死和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積誘發(fā)的心肌重構(gòu)導(dǎo)致梗死心肌發(fā)生由軟到硬的時(shí)間依賴(lài)性彈性變化的科學(xué)事實(shí),據(jù)此,我們提出了AMI后一定時(shí)間窗內(nèi)的心肌彈性可能更有利于移植細(xì)胞向有利于心功能改善的方向分化的科學(xué)假說(shuō),這一時(shí)段即

3、為最佳移植時(shí)機(jī)。
　　 本研究旨在通過(guò)一系列研究驗(yàn)證該假說(shuō)及其前提的正確性,對(duì)于這一科學(xué)命題的論述將有益于骨髓源細(xì)胞移植治療AMI的時(shí)機(jī)選擇及最佳移植時(shí)機(jī)潛在機(jī)制的闡明。
　　 第一部分移植時(shí)間對(duì)急性心肌梗死后骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植療效和安全性影響的薈萃分析
　　 目的：通過(guò)Meta分析的亞組分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)移植時(shí)間對(duì)急性心肌梗死(AMI)后骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)移植療效和安全性的影響。
　　 方法：系統(tǒng)

4、檢索PubMed、Medline、CochraneEBMReviews、EMBASE、BIOSIS等數(shù)據(jù)庫(kù)。以AMI癥狀出現(xiàn)24小時(shí)內(nèi)成功實(shí)施經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)者為研究對(duì)象;試驗(yàn)設(shè)計(jì)體現(xiàn)隨機(jī)對(duì)照原則;移植細(xì)胞種類(lèi)為非動(dòng)員的自體BMSCs;具有3個(gè)月以上的隨訪資料。樣本總量小于10的研究未被納入。
　　 結(jié)果：共檢出相關(guān)文獻(xiàn)349篇,篩選出符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)共9篇,涉及7項(xiàng)研究,總病例數(shù)660例。其中心肌梗死后24小時(shí)

5、內(nèi)移植亞組271例,4-7天移植亞組389例,與對(duì)照組相比,BMMNCs移植可顯著改善左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室收縮末容積(LVESV)。亞組綜合效應(yīng)分析顯示,4-7天移植亞組能夠明顯提高LVEF和減少LVESV(LVEF:權(quán)重均差[WMD]=4.63％,95％CI1.00％-8.26％,p=0.01;LNESV:標(biāo)化均差[SMD]=-0.28,95％CI-0.53——0.02,p=0.03),而24小時(shí)內(nèi)移植亞組僅顯示出有益趨勢(shì),

6、兩亞組相比,4-7天移植亞組較24小時(shí)內(nèi)移植亞組可能更有利于LNEF和LVESV的改善,但兩亞組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。而移植時(shí)間對(duì)左室舒張末容積(LVEDV)呈中性影響。死亡、支架內(nèi)或罪犯血管再狹窄、再次心肌梗死、再次血運(yùn)重建、因心力衰竭再入院等獨(dú)立不良事件及死亡、再次血運(yùn)重建、再次心肌梗死或因心力衰竭再入院的聯(lián)合終點(diǎn)發(fā)生率均顯示出BMMNCs移植治療的有益趨勢(shì)(比值比[OR]均＜1,但p均＞0.05)。與對(duì)照組相比,4

7、-7天移植亞組能夠明顯降低再次血運(yùn)重建率(OR=0.60,95％CI0.37-0.97,p=0.04)、死亡或再次心肌梗死的聯(lián)合發(fā)生率(OR=0.32,95％CI0.11-0.95,p=0.04)及死亡、罪犯血管再狹窄、再次心肌梗死或室性心律失常的聯(lián)合發(fā)生率(OR=0.59,95％CI0.36-0.96,p=0.03),而這些指標(biāo)在24小時(shí)內(nèi)移植亞組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異;兩亞組間相比,4-7天移植亞組的再次血運(yùn)重建率明顯低于24小時(shí)內(nèi)移

8、植亞組(交互p=0.02)。
　　 結(jié)論：自體BMMNCs移植治療AMI安全可行,移植時(shí)間是移植療效和安全性的重要影響因素,AMI后4-7天進(jìn)行細(xì)胞移植較24小時(shí)內(nèi)移植其療效和安全性可能更佳。
　　 第二部分心肌梗死后不同時(shí)期心肌彈性、血清VEGF濃度及心臟功能變化
　　 目的：探討小鼠心肌梗死后心肌彈性、血清VEGF濃度和心臟功能的時(shí)間變化規(guī)律及其潛在聯(lián)系,為進(jìn)一步分析心肌彈性和VEGF在骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMM

9、NCs)分化中的作用和相互作用創(chuàng)造條件。
　　 方法：六周齡雄性BALB/c小鼠48只,體重20-25g,采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制成心肌梗死模型,以假手術(shù)動(dòng)物為對(duì)照。分別于心肌梗死后1小時(shí)、24小時(shí)、7天、14天和28天,行心臟功能和左心室腔內(nèi)壓力檢測(cè)后,采用ELISA方法檢測(cè)血清VEGF濃度。每組送檢3個(gè)標(biāo)本,應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)梗死心肌彈性模量(E);其余心臟組織制成石蠟切片行蘇木素-伊紅(HE)染色和Mallary纖維染色。多

10、組間兩兩比較采用單因素方差分析,p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義,應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)理分析。
　　 結(jié)果：梗死后1小時(shí)心肌彈性模量輕微降低(由對(duì)照組心肌的17.94kPa降至16.60kPa,p＞0.05);24小時(shí)后降至最低值(4.21kPa,p＜0.001),其后梗死心肌彈性逐漸增加,由梗死后7天的31.38kPa增至4周后的90.22kPa(與對(duì)照組相比,p均＜0.001)。梗死后不同時(shí)間點(diǎn)血清VEG

11、F檢測(cè)顯示,心肌梗死后1小時(shí)VEGF濃度由正常對(duì)照的38.58pg/ml升至49.44pg/ml(p=0.024),至24小時(shí)達(dá)峰值(96.30pg/ml,p=0.005),心肌梗死后7天、14天和28天逐漸下降(VEGF濃度分別為50.56pg/ml[p=0.014]、43.89pg/ml[p＞0.10]、39.82pg/ml[p＞0.10],p值均為與對(duì)照組相比)。組織病理染色顯示,心肌梗死后24小時(shí),出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞壞死,炎性細(xì)胞

12、浸潤(rùn)與各組相比最為明顯;至梗死后7天,膠原纖維逐漸增多,早期疤痕組織開(kāi)始形成;梗死后14天和28天,纖維疤痕組織逐漸成熟。心肌梗死后心臟功能和左心室腔內(nèi)壓力的改變表現(xiàn)出與上述理化參數(shù)相似的變化趨勢(shì),AMI后24小時(shí)LNEF、FS和INESP降至最低點(diǎn)(VEGF,0.50對(duì)0.86[對(duì)照組],p＜0.01:FS,0.25對(duì)0.55,p＜0.01:LVESP,99.30mmHg對(duì)144.67mmHg。P＜0.01),且此時(shí)LVEDP亦達(dá)到首

13、個(gè)峰值(12.35mmHg對(duì)3.89mmHg[對(duì)照組],p＜0.01)。
　　 結(jié)論：小鼠心肌梗死后心肌彈性模量、血清VEGF濃度和心臟功能均表現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性相關(guān)變化且相互之間保持較高的一致性。梗死心肌的彈性模量經(jīng)歷了先降低后逐漸增高的變化過(guò)程,AMI后24小時(shí)心肌彈性模量降至最低,而此時(shí)血清VEGF濃度達(dá)到峰值;心肌梗死區(qū)域炎癥反應(yīng)亦最為明顯,且心肌梗死后心臟功能受抑最為明顯。
　　 第三部分基質(zhì)彈性和VEGF在骨髓單

14、個(gè)核細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化中的作用
　　 目的：應(yīng)用可以模擬梗死后不同時(shí)期心肌彈性的彈性可控性細(xì)胞培養(yǎng)體系,探討基質(zhì)彈性及VEGF在誘導(dǎo)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)向內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)分化中的作用和相互作用。
　　 方法：采用不同配比濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺制成不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠;利用原子力顯微鏡篩選出能模擬心肌梗死后1小時(shí)、24小時(shí)、7天、14天和28天心肌彈性模量的凝膠用于細(xì)胞培養(yǎng)。采用密度梯度離心法分

15、離BMMNCs,每一彈性模量的基質(zhì)膠上分別采用0ng/ml、2.5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml等四個(gè)濃度的VEGF進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。7天后進(jìn)行乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)吞噬/荊豆凝集素-1(UEA-1)結(jié)合雙陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)及EPC表面標(biāo)志物CD133、CD45、VEGFR2流式細(xì)胞分析。同一基質(zhì)彈性或同一濃度VEGF下的數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析,基質(zhì)彈性和VEGF對(duì)促細(xì)胞分化的相互作用分析應(yīng)用兩因素方差分析,p

16、＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義,應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)果：篩查出4種不同濃度凝膠的彈性模量(分別約為4kPa、15kPa、42kPa和72kPa)可分別模擬梗死后24小時(shí)、1小時(shí)、7-14天和14-28天的梗死心肌彈性。FITC-UEA-1/DiI-AcLDL雙陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示,在較高濃度VEGF(10-20ng/ml)培養(yǎng)條件下,貼壁細(xì)胞雙陽(yáng)性表達(dá)率在各彈性基質(zhì)問(wèn)無(wú)顯著差異(p均＞0.

17、05);當(dāng)VEGF濃度降至2.5ng/ml,42kPa基質(zhì)膠的雙陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于15kPa(72.44％對(duì)52.44％,p=0.04),且雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)大于其他彈性凝膠(p＜0.01);在無(wú)VEGF的培養(yǎng)條件下,42kPa在雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率和細(xì)胞數(shù)量上表現(xiàn)出較其他彈性更大的優(yōu)勢(shì),此外,4kPa和15kPa雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率較72kPa顯著降低(p均＜0.05)。兩因素方差分析顯示,基質(zhì)彈性和VEGF濃度對(duì)BMMNCs向EPC的分化存在

18、顯著交互作用(p＜0.01),分別控制VEGF濃度和基質(zhì)彈性的影響后,42kPa的基質(zhì)彈性和較低濃度的VEGF(2.5-10ng/ml)較其他彈性和濃度具有更高的的雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率。此外,流式細(xì)胞分析表明,低濃度VEGF(2.5ng/ml)條件下,EPC特征性表面標(biāo)記物CD45(-)/VEGFR-2(+)/CD133(+)細(xì)胞表達(dá)率以仍以42kPa為最高(1.94％)。
　　 結(jié)論：基質(zhì)彈性在促進(jìn)BMMNCs向EPC分化中發(fā)揮著

19、重要作用,42kPa(模擬心肌梗死后7-14天心肌彈性)的促細(xì)胞內(nèi)皮系分化效應(yīng)優(yōu)于其他彈性模量?；|(zhì)彈性與VEGF濃度在促進(jìn)BMMNCs向EPC分化過(guò)程中可能發(fā)揮著協(xié)同作用。
　　 第四部分心肌梗死后骨髓單個(gè)核細(xì)胞最佳移植時(shí)機(jī)及其潛在機(jī)制
　　 目的：通過(guò)對(duì)心肌梗死不同時(shí)期BMMNCs移植后心臟功能改善狀況的研究,探討心肌梗死后BMMNCs移植的最佳時(shí)機(jī)及其潛在機(jī)制。
　　 方法：采用密度梯度離心法分離BALB/

20、c小鼠BMMNCs。分別于心肌梗死后1小時(shí)、24小時(shí)、7天、14天和28天實(shí)施梗死區(qū)域BMMNCs局部注射,以相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)M199注射為對(duì)照,各組于心肌梗死建模后2月,應(yīng)用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)和心腔導(dǎo)管壓力測(cè)試系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施左心功能和左心室腔內(nèi)壓力測(cè)定,通過(guò)vWF免疫組化方法檢測(cè)移植區(qū)域毛細(xì)血管密度。移植組與各對(duì)照組比較用成組t檢驗(yàn),多組間兩兩比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA),p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義,應(yīng)用SPSS11.

21、5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比,心肌梗死后24小時(shí)至14天實(shí)施BMMNCs移植可顯著提高梗死區(qū)域毛細(xì)血管密度(對(duì)照組:1.32個(gè)/高倍鏡[HP];AMI后24小時(shí)移植組:2.60個(gè)/HP;7天移植組:4.60個(gè)/HP;14天移植組:3.80個(gè)/HP;p均＜0.001),其中以7天移植組的毛細(xì)血管密度為最高(兩者相比p=0.124)。各移植組LVEF、FS、LVEDP、LVESP及±dp/dt的絕對(duì)增量相比,亦

22、顯示出相似變化,且以AMI后7天和14天移植組改善最為明顯,優(yōu)于24小時(shí)移植(△LVEF:20.95％對(duì)11.41％,p=0.025;△FS:13.47％對(duì)7.13％,p=0.023;△LVEDP:-15.94mmHg對(duì)-8.17mmHg,p＜0.05;+△dp/dt:9001.02mmHg/s對(duì)4891.53mmHg/s,p＜0.05),而與14天移植組相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無(wú)顯著意義(△LVEF:18.82％,p=0.57;△FS:11.

23、63％,p=0.46;△LVEDP:-15.34mmHg;△LVESP:9.19mmHg;-△dp/dt:-4650.71mmHg/s;+△dp/dt:8265.35mmHg/s,p均＜0.05)?！鱈VEF、AFS、△LVEDP及△LVESP等心臟功能相關(guān)參數(shù)和毛細(xì)血管密度間存在高度線(xiàn)性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)均＞0.75,p均＜0.01)。此外,7天移植組和14天移植在LVIDd和LVIDs的改善方面呈現(xiàn)的有利趨勢(shì)亦最為明顯,但與其他各組相比