ICA69通過C末端結(jié)構(gòu)域影響PICK1-PKCα復(fù)合物運(yùn)輸和小腦可塑性.pdf

1、背景:PICK1(protein interacting with C-kinase1)是PKC結(jié)合蛋白，是突觸可塑性不可或缺的蛋白。PICK1-PKCα復(fù)合物到細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)是GluR2內(nèi)吞及其長時(shí)程抑制(long-term depression，LTD)的關(guān)鍵。ICA69已被證實(shí)是PICK1最主要結(jié)合蛋白，體內(nèi)生理情況下，大部分PICK1與ICA69彼此形成異源性復(fù)合物。除了BAR結(jié)構(gòu)域，ICA69(islet cell autoa

2、ntigen69 kDa)也包含一個(gè)C末端的結(jié)構(gòu)域（ICAC，ICA69蛋白的257-480段氨基酸），在其它蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)與ICAC結(jié)構(gòu)域明顯同源的結(jié)構(gòu)域。培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染ICA69可使表達(dá)的PICK1從突觸重新分布到樹突。雖然PICK1和ICA69形成異源性BAR結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為可能是相互結(jié)合的基礎(chǔ)，然而ICA69的ICAC結(jié)構(gòu)域在PICK1和ICA69復(fù)合物中的功能仍然未知，我們的實(shí)驗(yàn)顯示ICAC結(jié)構(gòu)域同樣能強(qiáng)烈結(jié)合PICK1，該

3、結(jié)構(gòu)域?qū)ICK1功能或許同樣有重大影響。
　　目的:探尋ICA69或ICAC結(jié)構(gòu)域是否對(duì)PICK1-PKCα膜運(yùn)輸和小腦可塑性產(chǎn)生影響，并進(jìn)一步探索機(jī)制，尋找ICA69和PICK1的結(jié)合的影響因素，期望最終能夠回答ICA69如何調(diào)控PICK1的功能，以及為以PICK1為靶標(biāo)的藥物多肽設(shè)計(jì)提供思路。
　　方法:我們利用Co-IP，蛋白免疫印跡，免疫細(xì)胞化學(xué)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)檢測(cè)ICAC或其截?cái)囿w與PICK1的

4、相互作用;利用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)觀察活細(xì)胞內(nèi)TPA激活下熒光蛋白的運(yùn)動(dòng);利用電生理技術(shù)檢測(cè)ICA69及它的不同結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)小腦浦肯野細(xì)胞的LTD影響。
　　結(jié)果:研究顯示，除了BAR結(jié)構(gòu)域，ICAC結(jié)構(gòu)域也能與PICK1強(qiáng)烈的相互作用。磷酸化、去磷酸化及其游離鈣離子濃度影響PICK1和ICA69相互作用。利用LSM實(shí)時(shí)觀察活細(xì)胞內(nèi)TPA激活下熒光蛋白的運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)ICA69或ICAC都能與PICK1相互作用而調(diào)節(jié)PIC

5、K1-PKCα復(fù)合物的膜轉(zhuǎn)位。ICAC和ΔICAC（包含BAR結(jié)構(gòu)域）在ICA69和PICK1相互結(jié)合調(diào)節(jié)PICK1-PKCα復(fù)合物膜轉(zhuǎn)位的過程中發(fā)揮不同的作用。ΔICAC易于形成聚集物，而ICAC多在細(xì)胞內(nèi)彌散狀分布。ICA69能抑制PICK1跟隨激活的PKCα膜轉(zhuǎn)位，ICA69的抑制功能主要由ICAC決定，ICAC結(jié)構(gòu)域也能抑制PICK1跟隨激活的PKCα膜轉(zhuǎn)位，而ΔICAC不能。電生理實(shí)驗(yàn)中灌注的MBP-ICA69和MBP-ICA