WISP1通過Akt信號通路調(diào)控人胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移.pdf

1、目的：
　　我們由上述背景資料推測:WISP1可能通過與Akt信號通路調(diào)節(jié)VSMC的增殖和遷移，從而參與血管再狹窄的發(fā)生。本研究擬通過WISP1對于人胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(HAVSMC)增殖和遷移的作用及相關(guān)信號通路的研究，以試圖進(jìn)一步探尋WISP1對血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控機(jī)制，為尋求新的血管再狹窄治療藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，并為藥物球囊的設(shè)計(jì)提供新的藥物靶點(diǎn)。
　　簡言之，本研究的目的為(1)檢測血管平滑肌細(xì)

2、胞增殖過程中WISP1的表達(dá)關(guān)系;(2)檢測WISP1蛋白與血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移關(guān)系;(3)探索WISP1蛋白調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移信號通路。
　　方法：
　　(1)觀察在不同濃度血清引起HAVSMC增殖狀態(tài)下細(xì)胞WISP1蛋白表達(dá)水平的影響:在細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下，使用不同濃度血清(0％FBS、2％FBS、10％FBS)培養(yǎng)胸主動脈血管平滑機(jī)細(xì)胞(HAVSMC)48小時(shí)后，使用EdU細(xì)胞增殖檢測法檢測組別間HAVS

3、MC的增殖狀態(tài)，同時(shí)利用Western blot技術(shù)檢測WISP1的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)各組間差異。
　　(2)構(gòu)建WISP1在HAVSMC中的過表達(dá)及缺失模型并驗(yàn)證:使用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別轉(zhuǎn)染含WISP1基因的腺病毒及空載體病毒(MOI=10)，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)在熒光顯微鏡下拍照，48小時(shí)后利用Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染病毒后兩組細(xì)胞中WISP1蛋白的表達(dá)水平。
　　(3) EdU細(xì)胞增殖檢測方法檢測過表達(dá)WI

4、SP1對細(xì)胞增殖變化影響:轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP1過表達(dá)腺病毒及空載體病毒后24小時(shí)，使用EdU細(xì)胞增殖檢測方法檢測轉(zhuǎn)染病毒后兩組細(xì)胞增殖水平，統(tǒng)計(jì)各組間EdU標(biāo)記陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)比值差異。
　　(4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測WISP1對細(xì)胞遷移的影響:轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP1過表達(dá)腺病毒及空載體病毒后24小時(shí)，選取5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)）在顯微鏡下觀察并記錄轉(zhuǎn)染病毒后兩組細(xì)胞遷移的情況，統(tǒng)計(jì)兩組間細(xì)胞遷移速度差異。

5、r>　　(5) Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)方法檢測WISP1對細(xì)胞遷移的影響:轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP1過表達(dá)腺病毒及空載體病毒后24h，收集細(xì)胞接種至Transwell小室上室（細(xì)胞數(shù)約為5×104個(gè)細(xì)胞），遷移24小時(shí)后固定、染色，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)兩組間遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)差異。
　　(6)觀察WISP1誘導(dǎo)HAVSMC增殖及遷移的信號通路激活情況:轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP1過表達(dá)腺病毒及空載體病毒后24小時(shí)，利用Western blot技術(shù)檢測Akt

6、，p-Akt的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析p-Akt/Akt比值差異。
　　(7)驗(yàn)證Akt信號在WISP1誘導(dǎo)HAVSMC增殖及遷移中的作用:轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP1過表達(dá)腺病毒及空載體病毒后24小時(shí)，使用或不使用Akt抑制劑AZD5363（濃度=5μM）處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，分別使用上述檢測增殖和遷移的方法，觀察過表達(dá)WISP1后抑制劑對HAVSMC增殖及遷移作用的影響，并使用Western blot技術(shù)檢測Akt下游分子p-GSK3/GSK3、MMP

7、9、cyclinD1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染病毒后兩組細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光，Western blot結(jié)果示，轉(zhuǎn)染含WISP1腺病毒的細(xì)胞（過表達(dá)WISP1組）中WISP1蛋白的表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染空載體病毒細(xì)胞組（空載體細(xì)胞組）(P＜0.05)。
　　(2)經(jīng)體外貼壁培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，血管平滑肌細(xì)胞的EdU標(biāo)記陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)比值與血清濃度呈劑量依賴方式增加，

8、對比無血清培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，EdU標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)比值分別增加2.5倍(2％FBS)和3.0倍(10％FBS)(P＜0.05)。低血清組細(xì)胞和高血清組細(xì)胞的WISP1表達(dá)水平明顯高于無血清培養(yǎng)細(xì)胞，WISP1蛋白表達(dá)量分別增加3.4倍(2％FBS)和4.1倍(10％FBS)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3) EdU細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，與空載體組細(xì)胞相比，過表達(dá)WISP1組的血管平滑肌細(xì)胞EdU標(biāo)記

9、陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)比值升高2.98倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，與空載體組細(xì)胞相比，過表達(dá)WISP1組的血管平滑肌細(xì)胞增殖細(xì)胞在6小時(shí)開始明顯快于空載體組細(xì)胞(4.56±1.14％ vs.11.23±2.25％，p＜0.05)，并在48小時(shí)兩組間差異達(dá)到最大(25.25±5.51％ vs.97.54±13.12％，p＜0.01);過表達(dá)組細(xì)胞在48小時(shí)細(xì)胞接近于融合。
　　

10、(5) Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，與空載體組細(xì)胞相比，過表達(dá)WISP1組的血管平滑肌細(xì)胞的遷移數(shù)量顯著多于空載體組細(xì)胞，上升2.25倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(6) Western blot檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，與空載體組細(xì)胞相比，過表達(dá)WISP1組的血管平滑肌細(xì)胞增殖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后的p-Akt表達(dá)量明顯增加，而總的Akt表達(dá)量未明顯變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)p-Akt/Akt比值升高3

11、.2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(7)轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP1過表達(dá)腺病毒及空載體病毒后24小時(shí)，使用或不使用Akt抑制劑AZD5363（濃度=5μM）處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（共4組細(xì)胞）。其中，與單純過表達(dá)組細(xì)胞相比，過表達(dá)WISP1組的細(xì)胞經(jīng)AZD5363處理后，EdU標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)比值下調(diào)(P＜0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:細(xì)胞遷移速度在12小時(shí)至48小時(shí)明顯減慢(P＜0.05);Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:遷移2

12、4小時(shí)細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示Akt下游分子:GSK3、MMP9、cyclinD1的蛋白表達(dá)也受到抑制，與單純過表達(dá)組細(xì)胞相比，過表達(dá)WISP1組的血管平滑肌細(xì)胞中檢測到p-GSK3/GSK3、MMP9、cyclinD1蛋白的表達(dá)量都呈下降趨勢(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)在不同濃度血清(0％FBS、2％FBS、10％FBS)刺激下的血管平滑肌細(xì)胞(HAVSMC)增殖水

13、平呈增高趨勢，促進(jìn)增殖的過程中內(nèi)源性WISP1表達(dá)與細(xì)胞增殖水平存在正相關(guān)關(guān)系。
　　(2)過表達(dá)WISP1能夠促進(jìn)血管平滑肌的增殖及遷移。
　　(3) WISP1促進(jìn)血管平滑肌的增殖及遷移過程中伴隨Akt信號通路激活。
　　(4)阻斷Akt信號可抑制WISP1調(diào)控血管平滑肌的增殖、遷移，同時(shí)下調(diào)Akt下游分子p-GSK3/GSK3、MMP9、cyclinD1的表達(dá)水平?？傊?，WISP1促進(jìn)血管平滑肌的增殖及遷移與Ak